[发明专利]一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用

说明书

一、技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种网红细胞生长因子及其制备方法和应用。 

二、背景技术

目前临床上用于治疗严重贫血的最有效药物当推红细胞生成素Erythropoietin（rhu-EPO）。自1989年美国Amgen公司的重组人EPO获得FDA批准上市后，已被普遍接受，现已发展为DNA重组药物中最成功的例子。EPO是红细胞生成中迄今发现的唯一的一个专一的增红因子，虽有报导干细胞生长因子（SCF），多种集落刺激因子（CSF_S）也对红细胞生成有促进作用，但它们的作用是多功能的，不是专一的。目前尚未发现新的治疗严重贫血的药物。 

三、发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种新的网红细胞生长因子（Reticulocyte Growth factor，RGF）及其制备方法和应用。 

本发明在研究过程中，在肾细胞培养液中，人尿和血浆中均发现有促红细胞生成活性的蛋白存在，但它们的分子量和免疫原性，甚至受体都和EPO不同。但该活性蛋白的含量很低，很难得到足够的纯品进行性质研究，最后发现来源于人血浆的α₁-antitrypsin制剂的杂质中有很高的促网红细胞生成的活性。本发明通过高压液相层析（HPLC）等生化纯化手段得到几个高活性蛋白，经鉴定均为α₁-antitrypsin的前缀（precusor）中的不同长度的肽段，带有不同长度的糖，有的成分含糖很少或者无糖。 

本发明的技术方案 

1、RGF的纯化 

a、Sigma公司的α₁-antitrypsin制剂（A-9024）源自人血浆，该制剂中存在很高的促网红细胞生成的活性。活性检查采用程雅琴教授的小鼠网红细胞测定法，具体方法描述如下： 

动物：ICR小鼠，体重18-22g，雄性 

样品：按RGF的活性稀释，一般在5-20μg/ml 

方法：3只小鼠为一组，肌肉注射0.06ml、0.12ml、0.24ml，连续注射3天，第4天眼眶取血，7-8滴加入已加有20μl100U/ml肝素钠的带盖小管中混匀，取出50μl血液，滴加在预涂在玻片一端已干的煌焦油兰染料上，充分混合，放入湿盒中30分钟。在二片载玻片上推成单层细胞，自然干燥后，甲醇固定，然后经瑞氏染液复染，同时滴加0.02mol/L PBS（PH6.8）勿使干枯，30分钟后用PBS或蒸馏水冲去染液。 

高倍油镜读片，网红细胞中核物质，可被煌焦油兰染成深蓝色点状、线状、链状或团状，而红细胞不含核物质。一般计数500-1000个红细胞，计算网红细胞所占百分率。每个样品读二张片子取平均值，每组3只小鼠再取平均值，减去对照组（0.12μl生理盐水）网红细胞百分率，为网红细胞净增%。每上升1%，定义为1个单位（U），以注射的蛋白量（一次注射量）计算比活性，即每mg蛋白质刺激上升的单位（U/mg）作为比活性。 

将α₁-antitrypsin制剂用生理盐水配成不同浓度，取ICR小鼠（体重18-22g,雄性）15只，3只一组分成5组，对照组肌肉注射0.12ml生理盐水，其余分组小鼠注射0.12ml不同浓度的antitrypsin制剂，连续注射3天后，第4天眼眶取血、煌焦油兰染色，油镜计数网红细胞在红细胞中的百分比。结果证明该制剂中促网红细胞生成的活性很强，可作为起始材料进一步分离纯化。结果见下表： 

表1 α₁-antitrypsin制剂的促网红细胞生成活性