[发明专利]一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，特别是一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体与应用。

背景技术

目前全球广泛用于生物防治病虫害的杀虫基因是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的Bt毒素基因（例如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F等）。苏云金芽孢杆菌是一种昆虫性病原细菌，其产生的Bt毒素对多种农、林害虫都有具有特异性毒杀作用。到1987 年比利时植物遗传系统公司(Plant Genetic Systems)就在世界上首次报道了转Bt 基因抗虫烟草获得成功，到现在，Bt 基因已经被转到玉米、水稻、棉花、番茄、马铃薯、烟草等世界主要农作物中。据2012 年国际生物技术应用服务组织统计，中国种植的转Bt 棉面积就已经超过390 万公顷，占棉花种植总面积的71.5 %。然而，随着转Bt 基因作物的应用和推广，其在基因逃逸、改变土壤微生物生态结构、物种的耐药性以及危害正常免疫系统等方面可能存在的潜在危害备受社会关注。“转Bt基因玉米根际微生物和细菌生理群多样性”（王敏等，生态学杂志，2010年03期）和“转Bt基因玉米对土壤细菌数量多样性的影响”（刘玲等，生态与农村环境学报，2011年03期）分别对室内、室外种植转Bt玉米的土壤进行了细菌数量和多样性分析，结果都发现种植转Bt玉米的与空白对照组相比出现显著差异。

“Cry1Ac protoxin from Bacillus thuringiensis sp.kurstaki HD73 binds to surface proteins in the mouse small intestine”（Vázquez-Padrón等，Biochem Biophys Res Commun，2000年01期）在动物试验发现，当小鼠摄取的Bt内、外毒蛋白达到10 mg/kg和100 mg/kg时，小鼠的T细胞ANAE阳性率、脾脏指数及巨噬细胞的吞噬功能均出现了明显的抑制反应，随着摄取剂量的增加，这种抑制作用越发明显。试验还发现，当Bt毒素蛋白在动物体内的蓄积系数大于6.24时，可以导致肝脏、肾脏及胃肠道等损伤，在肝脏和肾脏中可以观察到细胞肿胀和空泡样变性异象，并且能看见肾小球血管上皮细胞的病变，当然这也不能排除是由免疫反应造成的。长期大剂量使用Bt毒素蛋白，还会导致动物白细胞总数和血红蛋白含量显著性下降，这也说明Bt毒素蛋白具有明显的免疫抑制毒性。开拓具有Bt毒素生物活性的替代生物效应物（例如：抗独特型抗体）是开发生物农药领域研究的热点。

人源化的抗体基因因其来源于人类，具有与人类免疫系统基因同源的优势，可以避免在其制剂喷洒或转基因表达后在食品中的残留而对人体免疫系统造成危害。

1974年，丹麦免疫学家Jerne在其“免疫网络学说(Immune Network Theory)”中首次提出抗独特型抗体的概念。抗独特型抗体(Anti-idiotype antibody，以下简称Anti-Id)是指针对位于抗体分子可变区的独特型(Idiotype，Id)产生的特异性抗体。Bona等根据Id与Anti-Id的血清学反应以及AId的功能，将抗独特型抗体分为4种类型(α，β，γ和ε)。β型抗独特型抗体由于具有“内影像”作用，即具有与(半)抗原相同的抗原决定簇，因而可以具有抗原的功能和生物活性。

目前普遍认为采用噬菌体展示技术，通过构建噬菌体抗体库，经特异性筛选，可以获得具有靶标抗原类似效应的抗独特型抗体。采用噬菌体展示技术筛选特异性抗体的过程称为“淘选(Panning)”，主要包括结合、洗涤、洗脱和扩增4个步骤。Raats等采用抗皮质醇单克隆抗包被做为固相抗原直接进行筛选，在进行筛选之前，用相同种属的阴性单克隆抗体进行负筛选以避免筛选到与抗体恒定区结合的重组抗体片段，最终成功筛选到针对皮质醇的Anti-Id。Goletz等同样利用噬菌体抗体展示系统并研究比较了不同洗脱方法对抗独特型抗体片段筛选结果的影响，最终筛选到的96个克隆中有28个为具有抗独特型特性的阳性克隆。目前针对可替代Bt毒素活性效应物，特别是抗Bt毒素类型的抗独特型单链抗体（以下简称Anti-Id ScFvs）等相关材料及产品还未见报道。

发明内容

  针对目前转Bt毒素作物及其毒素制剂的广泛应用存在的安全隐患及超敏反应等问题，开拓具有Bt毒素生物活性的可替代生物效应物及其在生物防治害虫中的应用，本发明是这样实现的：