[发明专利]一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。

背景技术

在此处键入背景技术描述段落几个世纪以来,硫化氢(H₂S)被认为是由地质活动或微生物作用产生的一种有毒物质。这种无色、可燃的气体具有令人恶心的臭鸡蛋气味,并可对哺乳动物的眼睛及呼吸系统产生强烈的刺激作用。吸入过量的硫化氢气体则可导致意识丧失、呼吸衰竭、心跳停止等生理反应,吸收量过大时可导致死亡。另一方面,现在越来越多研究己经开始挑战这种传统的观念:哺乳动物自身可以在受控的条件下产生硫化氢,并认为硫化氧对于维持正常的生理功能具有重要作用。在哺乳动物体内硫化氢可由非酶作用产生,包括体内硫库的释放及聚硫化合物的代谢等。也可由多种酶参与催化合成,包括胱硫醚-聚合酶(CBS)、胱硫醚-裂解酶(CSE)、半胱氨酸转移酶及疏基丙酮酸转硫酶。这些酶可通过不同的反应催化含硫的生物分子如半胱氨酸、高半光氨酸等产生硫化氢。这几种酶出现在心脏、脉管系统、脑、肾脏、肺及胰腺等多种器官的组织中,说明了硫化氧在哺乳动物体内的分布很广泛。

在哺乳动物体内,硫化氢可与下游蛋白质通过转译后的半胱氨酸发生巯基化反应并连接在血红素的铁中心上。这一过程将控制多种生理反应,包括局部缺血再灌注引起的损伤、血管舒张、细胞死亡、血管生成、神经调节、炎症治疗、胰岛素信号传导和氧气应激等。此外,硫化氢也作为活性氧的抗氧化剂或清除剂而发挥作用。但是H₂S的浓度水平不正常己被证实与很多疾病有关。这些开创性的实验已经表明硫化氢是一种重要的生理调控气体而不单单是一种污染物。硫化氢复杂的生理角色及潜在的治疗应用促使科研工作者提出新的方法用于监测硫化氢的产生、流通和在不同细胞、组织及器官内的消耗过程。

传统用于检测硫化氢的方法包括比色测定法、极谱传感法和气相色谱法通常会引起待测样品的损伤,或是根本不能实现对生物体内硫化物的检测。荧光分子探针提供了一个引人注的方法,由于其具有细胞膜通透性和高选择性,因而可实现在生物体系中对硫化氢及其他生物小分子的检测。荧光光分析法将为研宄硫化氢的生理功能提供重要要的生物信息。设近两年来,有关硫化氢光检测的报道受到研究工作者的高度关注。

本发明提供了一类试卤灵衍生物用于特异性识别硫化氢（H₂S）的探针，其与硫化氢水解后可生成具有荧光属性的水解产物。该反应具有高选择性、高灵敏度、反应迅速的特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种识别硫化氢的特异性荧光探针，该探针本身具有微弱的荧光，与硫化氢反应后产物具有极强的荧光属性。利用该探针反应可对多种生物样本中硫化氢含量进行定量评价。

本发明的技术方案为：一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针，所述荧光探针为试卤灵衍生物，其结构式如下：

所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：

（1）按照试卤灵钠盐：2,4-二硝基溴苯：碳酸钾摩尔比为1:1~2：2~3的比例加入到反应瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺，控制反应温度在40~80℃，搅拌8-12h；

（2）将上述反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯：正己烷体积比为1: 1进行洗脱，得荧光探针。

所述荧光探针应用于生物样本中硫化氢含量的定量评价。该探针作为硫化氢的特异性探针，发生水解反应，通过定量检测水解产物的荧光强度来测定细胞中硫化氢的含量；具体测定方法为：

体系中以试卤灵衍生物作为特异性探针；探针浓度选择1/~10μM；在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液：乙醇混合溶液（体积比9:1）中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；反应体系pH介于5.5~10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；反应时间为5~120分钟；测定水解产物荧光强度作为硫化氢含量的评价指标。

探针本身具有微弱荧光，其水解产物均具有极强的荧光，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长550~590 nm，在600~650 nm进行荧光发射谱的检测。