[发明专利]显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物快速繁殖技术领域，尤其涉及显著提高野生百合愈伤组织继代增殖率的培养方法。

背景技术

百合胚性愈伤组织再生体系对建立遗传转化体系具有重要意义，通过继代培养保持愈伤组织系可以为后期的遗传转化提供可随时获得的原材料，由于转基因技术转化效率目前仍较低，高增殖率的愈伤组织是在短期内获得充足愈伤组织以保证不断进行转基因操作，以取得转基因的必要条件。

对于百合胚性愈伤组织的继代，现有技术主要是通过在同一种继代培养基及培养条件下培养，以4-8周为周期，将上一次继代的愈伤组织团块分成较小团块后，接种到新鲜培养基上培养，使其进一步增殖；针对现有技术的改良，已有报道主要是围绕继代培养基配方中植物生长调节剂等物质的浓度和比例的改变。但定期扩繁（每4-8周）需要较高的时间人力成本，同时扩繁增殖率相对较低。伴随继代次数增加，愈伤组织胚性退化、再生能力下降。如何能在节约人力时间的同时获得较高的愈伤组织增殖率是技术瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法，包括以下步骤：

（1）愈伤组织的诱导培养：在超净工作台上，取野生百合组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm，并在其近轴面用解剖刀划1～3个创口，接种时以创口朝下接触愈伤诱导培养基表面，愈伤诱导培养20～50天后，获得直径0.3～0.5cm的浅黄色、颗粒状的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为63.3%～79.1%（其中，鳞片上的创口是产生愈伤组织的关键，创口接触培养基可以使植物充分感应培养基中的激素等物质，以产生愈伤）；

所述愈伤诱导培养是在完全黑暗、25℃的愈伤诱导培养条件下进行；用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述愈伤诱导培养基中还含有浓度为0.1～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)、0～1.0mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA）、浓度为0.1～0.4mg/L的6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、30g/L的蔗糖、6～8g/L琼脂，愈伤诱导培养基的pH值为5.8（其中，2,4-二氯苯氧乙酸对愈伤组织的诱导是关键的）；

（2）愈伤组织的继代培养：愈伤诱导培养60～90天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上；每个装有继代培养基的培养皿中接种20～30块愈伤组织团块，愈伤组织团块的直径在0.3～0.5cm之间，每4周继代一次，每次继代可获得每月2～2.5倍的增殖率，即愈伤组织团块经过一个月的培养，重量增加为接种时的2～2.5倍；

所述继代培养是在完全黑暗、25℃的继代培养条件下进行；用于接种的继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述继代培养基中还含有浓度为0.1～2.0mg/L的2,4-D、0～1mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA）、0.1～0.4mg/L的6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、30g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂，继代培养基的pH值为5.8（其中，2,4-二氯苯氧乙酸对愈伤组织脱分化状态的维持是关键的）；

（3）愈伤组织的扩增培养：

愈伤组织团块在继代培养基上继代培养1～8个月后，将愈伤组织团块分切成0.5cm的小块，接种到含继代培养基的培养皿上，依次用经过紫外灭菌的保鲜膜和锡纸包裹，然后进行30～60天的低温处理，低温处理条件为1～4℃，完全黑暗（低温处理能够抑制愈伤组织在继代培养基上出现的分化情况，保持愈伤组织在脱分化状态并有利于愈伤组织的增殖，黑暗条件有利于愈伤组织的诱导和增殖，保持愈伤组织的脱分化状态）；

再将低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，进行弱光培养，弱光培养是指在光照100～900lux、温度25℃的条件下进行，且扩增培养基装在口径为6.35cm，高度为9.20cm的柱形瓶中；