[发明专利]一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术应用领域和环境监测技术领域，具体采用免疫磁珠的免疫学反应原理及磁场力的特性富集水体中污染的甲肝病毒。

技术背景

甲肝病毒（Hepatitis A Virus，HAV）是一种RNA病毒，属小RNA病毒科，嗜肝病毒属，为常见的肠道病毒之一。甲肝病毒高浓度存在于感染者的粪便中，早在1973年，Feinslone利用免疫电镜技术在患病者的粪便样品中观测到了甲肝病毒(Martin and Lemon2006)，它们主要通过粪-口途径传播，无论是直接从人到人的传播或是接触了受污染的食物或水域，都会引起暴发流行。甲肝病毒较一般肠道病毒抵抗力强，耐酸碱，室温下可生存1周，在淡水、海水、污水以及海产品中（如毛蚶）存活数天至数月，25℃时在干粪中能生存30天。

我国是甲型肝炎的高发区，在卫生条件比较差的农村，由于无自来水设施，人们多饮用井水、河水。若不慎饮用了污染水源，极易引起感染；在一些城市和发达的江浙沪等地区，人群甲肝病毒的流行也呈逐年增加的趋势，因此依然有暴发流行的可能，且这种危险将长期存在。由此可见找到高效准确检测甲肝病毒方法的重要性。2012年国家饮用水卫生监督监测工作方案明确规定将甲肝病毒列为水性疾病监测的重要对象。

水体中甲肝病毒检测的难点在于含量低、干扰测定的基体成分复杂，给准确测定造成了很大的困难。大部分水体需通过水样体积的浓缩，先将病毒富集，才能进行检测，但水中不必要的污染物也因此被富集，从而干扰实验结果。如通常使用絮凝沉淀法对水样进行浓缩，但其残留的有机物质可能会对PCR的检测结果造成影响。另外传统的病毒富集检测方法,如细胞培养病毒鉴定,在操作上比较耗时，在技术成本的花费上比较昂贵，而且甲肝病毒很难在体外环境下培养(Brooks,Gersberg et al.2005)。

免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads separation techniques,IMBS)是上世纪后期发展起来的一项免疫学检测和磁性分离相结合的免疫学技术。免疫磁珠以磁性微球为载体，通过功能基团（羧基、氨基、羟基、醛基等）共价结合免疫配基（酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA等生物活性物质），利用特异性的免疫学反应在外部磁场力的作用下分离检测靶物质。其具有灵敏度高、分离速度快、特异性强、操作简便、可重复性好，不需要昂贵的仪器设备等优点。另外，免疫磁珠分离技术与荧光定量PCR检测技术相结合，能有效祛除PCR反应的抑制物(Haramoto,Kitajima et al.2010)。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性强、操作简便、省时高效的水体中甲肝病毒的富集方法，它以水体中的甲肝病毒为对象，采用免疫磁珠特异性吸附甲肝病毒，又在磁场力的作用下分离，实现水体中甲肝病毒的富集。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其步骤包括：

（1）制备富集甲肝病毒的特异性免疫磁珠：

通过活化羧基磁珠，磁珠与甲肝病毒抗体偶联和封闭的步骤制备所述特异性免疫磁珠；

（2）免疫磁珠富集甲肝病毒：

将1mg制备的特异性免疫磁珠与300μl甲肝病毒吸附，室温孵育2小时；

（3）定量检测甲肝病毒的富集效率：

提取甲肝病毒RNA，反转录成cDNA；荧光定量PCR检测水体富集的甲肝病毒拷贝数；计算甲肝病毒富集效率。

所述的定量检测甲肝病毒的富集效率时，使用Trizol法提取病毒RNA，具体是：将吸附病毒的免疫磁珠加入600μl Trizol，室温静置5min；再往EP管中加入300μl氯仿，震荡30秒，在冰上放置5分钟后，12000r/min、4℃离心15min，磁珠沉降在EP管底部；轻轻吸取上层水相液体，置于新的无RNA酶EP管中，余下部分丢弃，再加等体积的异丙醇和1μl Glyco Blue Coprecip，震荡后在-20℃冰箱放置2分钟，12000r/min、4℃离心10min；弃去上清液，加200ml75%乙醇进行洗涤，12000r/min、4℃离心10min；、弃掉上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用12μl Rnase-free water溶解RNA。

本发明使用的磁珠为以超顺磁性Fe₃O₄为内核、粒径为3μm的羧基磁珠，使用的甲肝病毒抗体为VP2蛋白抗原决定簇的鼠源单克隆抗体。