[发明专利]β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物生物转化技术领域，尤其涉及一种β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用。 

背景技术

白藜芦醇是中草药虎杖中的一种天然活性物质，化学名称为芪三酚(即3，5，4’－三羟基－l，2一二苯基乙烯)，是一种活性多酚物质，分子式为C₁₄H₁₂O₃。虎杖中白黎芦醇往往以葡萄糖苷(即虎杖苷)的形式存在，虎杖苷在肠道中糖苷酶的作用下可分解为白黎芦醇，而发挥药理作用。白黎芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等作用，白黎芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一，它是继紫杉醇以后的又一绿色抗癌物质。白黎芦醇具有独特的化学和生理活性，在护肤品中可起到多重作用，例如抗氧化、抗衰老、抗紫外线、增白及保湿等，因而对多种因素造成的皮肤老化(皱纹和色素沉着)都有独到的功效。现代方法获得白黎芦醇主要有直接从植物中提取、化学合成法、复合酶酶解法和生物合成法等。目前，有人用酸碱水解法或改性纤维素酶解法对虎杖苷进行分解，但是酸碱会造成环境污染还降低产量，而改性纤维素酶法成本较高、工艺较为复杂，因此均不利于推广应用。 

国内近年来β-葡萄糖苷酶的研究已经成为热点，已由过去研究β-葡萄糖苷酶的简单提取到现在的产酶条件优化以及粗酶液的纯化。虽然β-葡萄糖苷酶基因已成功克隆表达，新构建的工程菌也已应用到生产实践中，但仍然存在很多不足，如：工艺复杂、成本过高，从而限制了其进一步发展。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：β-葡萄糖苷酶高产菌，保藏编号为CCTCC NO.M2013633，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae）HHL。 

上述β-葡萄糖苷酶高产菌在转化制备白藜芦醇中的应用。 

利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，包括以下步骤： 

（1）种子制备：将保存的米曲霉HHL孢子接种于斜面培养基上，置于35℃恒温培养箱培养2天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵 培养基；斜面培养基为查氏培养基；摇瓶发酵培养基是产酶优化培养基； 

（2）转化制备白藜芦醇：在温度为35℃、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1%、转速180r/min的条件下发酵120h，加入10%虎杖液，在温度为50℃、pH5.0的条件下反应5h。 

孢子悬浮液浓度为1.0×10⁸个/ml。 

虎杖液按以下操作制备：取10g虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后小火煮沸30分钟左右，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水定容至100ml，得虎杖煮提液。 

产酶优化培养基配方为麸皮汁10%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%。 

发明人以虎杖为碳源从自然界中筛选到一株β-葡萄糖苷酶产生菌（保藏编号为CCTCC NO.M2013633，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae）HHL），该菌能高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇。据此，发明人建立了一种利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，采用产酶基础培养基，分别从碳源、氮源、接种量、底物浓度、装液量、转化温度、转化时间、转化pH等几方面进行单因素实验分析优化，确定微生物发酵产酶的最佳条件及微生物转化得到产物白藜芦醇的最佳条件，一方面可在温和条件下水解白藜芦醇苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，有效地提高了产量；另一方面利用现代微生物发酵工程技术和酶工程技术使虎杖的有效成分白藜芦醇苷在体外可控条件下实现规模转化，降低了生产成本，提高了生产效率。应用本发明可为大量工业化生产β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇提供一条可行途径，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。 

附图说明

图1是米曲霉HHL产酶条件优化—发酵时间对产酶的影响结果图。 

图2是米曲霉HHL产酶条件优化—碳源对产酶的影响结果图。 

图3是米曲霉HHL产酶条件优化—氮源对产酶的影响结果图。 

图4是米曲霉HHL产酶条件优化—磷酸二氢钾浓度对产酶的影响结果图。