[发明专利]一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备混合溶剂：首先制备离子液体氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑（AMIMCL），将一定量的甲基咪唑和氯丙烯混合溶液加入到的双口烧瓶中，其中混合溶液中的甲基咪唑与氯丙烯体积比为1:1.1到1:1.9之间，在氮气中保护五分钟，之后在油浴中恒温加热回流一定时间；用无水乙醚对反应物进行数次萃取，再加入活性炭和去离子水后，在油浴中一定温度下对反应物再次进行数小时回流，过硅藻土得到淡黄色的液体，将其真空旋转蒸发，之后再真空干燥48小时制得AMIMCL；再将4-甲基吗啉-N-氧化物（NMMO）和所制得的 AMIMCL按照不同的质量比进行混合，混合体系中NMMO的质量分数分别为9-90%；

  2）制备细菌纤维素溶液：取一定量的细菌纤维素溶于上述NMMO和AMIMCL混合溶剂中,在密闭容器中油浴加热,保持在一定温度条件下反应,在持续搅拌12-24小时后,即可得到黄色液体,从而制备出不同质量分数的0.5-20%的细菌纤维素溶液；

3）制备胶原蛋白溶液：将一定量的胶原蛋白溶于六氟异丙醇，50℃微热搅拌至完全溶解，得到不同质量分数的0.5-20%的胶原蛋白溶液；

4）制备细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将细菌纤维素和胶原蛋白溶液以各种比例混合，得到总质量分数为0.5%-20%的胶原蛋白和细菌纤维素的混合溶液；

5）制备含有AgNO₃或金、银纳米簇等的细菌纤维素和胶原蛋白混和溶液：将上述细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液中加入一定质量的AgNO₃或金、银纳米簇等溶液，充分混匀；

6）含AgNO₃或金、银纳米簇的上述混合溶液进行静电纺丝：将一定量的AgNO₃或金、银纳米簇等溶液分散于聚合物溶液中，将含有AgNO₃或金、银纳米簇等的胶原蛋白和细菌纤维素溶液进行有序结构静电纺丝，得到AgNO₃或金、银纳米簇等/胶原蛋白/细菌纤维素复合纳米纤维；

 7）制备载纳米银复合纳米纤维：将静电纺丝得到的AgNO₃/胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维在紫外光照射下进行光还原，光还原后的复合纤维颜色逐渐变为浅黄，表明银纳米颗粒的形成；

 8）制备的纳米纤维支架用于细胞培养：将相应类型的细胞植入上述各类孔径大小的支架中，然后整体放置于细胞培养液中进行培养，培养一段时间后观察具体效果。

2.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤1）中的NMMO和AMIMCL的质量比在1:10到10:1之间。

3.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤2）中的细菌纤维素溶液制备中，反应温度为10℃到110℃。

4.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤4）中的细菌纤维素溶液：胶原蛋白溶液的体积比是1：5到5:1之间。

5.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤6）中已配好的范围在0.5%到20%之间的不同浓度的混和溶液转移到注射器中，在范围为10kv到30kv之间的不同外加电场强度以及在5cm到20cm之间的不同接收距离范围内进行静电纺丝。

6.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤8）中采用的细胞培养液为50ml胎牛血清 (FBS）与440ml的DMEM培养基，培养仪器为六孔板，加入75%酒精，浸泡消毒5小时，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗6次，每次5ml，浸泡时间不少于12小时，然后用DMEM培养基浸泡材料半小时左右，放入CO₂培养箱，过夜晾干，用于内皮细胞培养；然后用移液枪吸取2ml内皮细胞悬液，种植在六孔培养板的各个孔中，然后放入CO₂培养箱培养4个小时，等内皮细胞基本粘附，再加入3ml预热到37℃的加有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养过程中根据消耗情况更换培养基，总共培养3-5天。

7.根据权利要求1所述的抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：步骤8）中首先在六孔板中加入75%酒精，浸泡消毒5小时，然后吸出酒精，晾干，用PBS溶液浸泡漂洗1-6次，每次5ml，浸泡时间不少于12小时，然后用DMEM培养基浸泡材料10-60分钟，放入CO₂培养箱，过夜晾干,用于平滑肌细胞的培养；然后用移液枪吸取2ml平滑肌细胞悬液，种植在六孔培养板的各个孔中，然后放入CO₂培养箱培养1-10小时，等平滑肌细胞基本粘附，再加入3ml预热到37℃的加有1%-10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养过程中根据消耗情况更换培养基，总共培养3-8天。