[发明专利]一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶脱色方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法。 

背景技术

蛋白酶是三大工业酶之一，其产量达到世界酶制剂产量的60%。由于蛋白酶能有效地去除及分解蛋白，所以其被大量用于洗涤剂行业中。近年来，随着绿色、环保、节能及低碳生活理念的深入，低温洗涤已成为一个趋势。低温碱性蛋白酶MP来自于海洋微生物，具有低温高效的催化性能。但由于蛋白酶发酵液中含有色素，影响了其应用外观品质。离子交换树脂自产生以来,已经广泛应用于食品工业、医药工业以及环境工程的富集、分离、纯化及脱色工艺中。 

发明内容

本发明的目的在于发明人长期开发研究海洋微生物酶的的应用研究及其生产实践,开发提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法。 

本发明提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP（属海洋微生物低温碱性蛋白酶,或称低温碱性蛋白酶MP,简称蛋白酶MP）脱色方法,包括下列步骤： 

1)D352阴离子交换树脂的处理 

首先将D352阴离子交换树脂(简称D352树脂)（D352购自上海劲凯树脂有限公司）用4wt%的HCl浸泡2-4h,后用去离子水洗至中性;再用4wt%NaOH浸泡6-8h，去离子水洗至中性，装于离子交换柱中（例如Φ46mm×305mm玻璃离子交换柱等，北京欣维尔玻璃仪器有限公司）,所述D352阴离子交换树脂为大孔型聚苯乙烯带有伯氨基的弱碱型阴离子交换树脂。 

2）低温碱性蛋白酶MP的制备 

将YS-80菌株接种于含有1.2wt%蛋白胨、2.4wt%酵母粉、0.4wt%甘油、2.5wt%NaCl的GB培养基中,于18℃连续培养48小时，此时检测发酵液中蛋白酶酶活可达到5000U/ml;然后，在4℃条件下，离心去除菌体，保留上清液,再用超滤浓缩的方式制备不同酶活的低温碱性蛋白酶MP酶液; 

3）低温碱性蛋白酶MP的脱色 

将步骤2制备的低温蛋白酶MP酶液流过步骤1的阴离子交换柱进行脱色，控制流速为4—8BV/ml,优选为6BV/ml;pH值为5—9,优选为6—7;温度为20—40℃,优选为30℃。 

本发明提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP（阴离子交换树脂）脱色方法中,脱色率的测定： 

配制浓度为1wt%的低温蛋白酶MP酶液，进行可见-紫外全波长扫描，发现在420nm有较强的吸收峰，所以选择420nm作为检测波长，测定酶液的吸光度，并按下式计算脱色率。 

R=(A-A₀)／A₀×100 

式中： 

R—脱色率； 

A₀—脱色前吸光度； 

A—脱色后吸光度。 

蛋白酶酶活的测定（Folin-酚法）： 

准确称取干酪素1.0g，用少许NaOH或乳酸润湿，溶于50mmol/L一定pH的缓冲液中，调pH，定容至100ml，配成10g/L的酪素溶液。酪素溶液与适当稀释比例的酶溶液预热10min后，各取1.0ml混合于30℃恒温水浴中，准确反应10min，用0.4mol/L三氯乙酸2.0ml终止反应。对照为先加三氯乙酸使酶失活再加酪素。将反应液过滤，取1.0ml于0.4mol/L Na₂CO₃5ml混合，再加1.0ml Folin试剂，震荡混匀，40℃显色20min，于680nm波长处比色。蛋白酶活力以1ml酶液1min水解酪素产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以U/ml表示。 

蛋白含量的测定：采用Lorry法。