[发明专利]一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒性疾病监测和诊断试剂领域，更具体地为一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪出现呼吸道疾病为特征的传染病。是世界动物卫生组织（Office International DesEpizooties, OIE）列入的93种法定报告的动物疫病之一。据统计，该病每年给美国的养猪业造成近5.6亿美元的经济损失（Cho and Dee, 2006）。我国于1996年从流产胎儿中分离到PRRSV，证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。随着病毒的遗传和变异，2006年，我国又爆发了以变异美洲型病毒为病原的高致病性蓝耳病（Tian K et al., 2007），使我国养猪业蒙受了巨大的经济损失。

目前检测PPRSV的方法主要有RT-PCR法、病毒分离鉴定、免疫组化法、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法，但这些方法要么需要操作活病毒，要么操作复杂、耗时长，要么特异性和敏感性不足，不利于基层的应用和推广。而现有ELISA方法主要以人工重组蛋白作为抗原，而且在用双抗夹心法检测抗原时很少用到酶标链霉亲和素放大信号的作用，从而使得特异性和敏感性都有所不足。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒。该试剂盒在保证特异性、敏感性和重复性的前提下，能够简单快速准确检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。

本发明的另一目的在于提供上述检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒的使用方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒，其组成包括包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板、生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体、酶标链霉亲和素、阳性对照、阴性对照、TMB显色液、终止液、洗涤液和稀释液。

所述的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体优选通过包含如下步骤的方法制备：利用Marc-145细胞培养PPRSV JXA1-R株，以超速离心纯化的PPRSV为抗原，与弗氏完全佐剂充分乳化后，免疫60日龄家兔，15天、30天分别用同样抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后各加强免疫一次，45天后采血，分离血清；用Protein A亲和层析纯化得到抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体。

所述的包被抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体的酶标板优选通过包含如下步骤的方法制备：将抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的多克隆抗体用包被液以每孔100ng/100μL包被酶标板， 4℃包被过夜后，用含有2% BSA的PBST 溶液37℃封闭2小时，再以pH 7.5的PBST洗涤3次，拍干备用；所述的包被液为0.1M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

所述的生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体的浓度优选为1mg/mL。生物素标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体优选通过包含如下步骤的方法制备：

（1）用无水DMSO配制10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液；

（2）用0.1mol/L、pH 8.8的硼酸盐缓冲液配制浓度至少为1～3mg/mL的抗体溶液；

（3）按25～100μg/mg的比率将生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4h；

（4）每250μg生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯内加入20μL 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min；

（5）将抗体溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素。

所述的酶标链霉亲和素的浓度优选为1mg/mL。