[发明专利]利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于：在如SEQ ID NO.1所述的AP2基因的上游加入羟胺裂解位点编码序列，然后在该基因片段的5’端加入EcoR I，3’端加入Xho I，合成后克隆入所述pUC57，形成带有AP2基因的重组载体pUC57-AP，然后将BmNPV的多角体基因polh克隆入所述带有AP2基因的重组载体中AP2基因的上游，即形成带有polh-AP融合基因片段的重组载体pUC57-polh-AP；接着polh-AP融合基因片段克隆入表达载体pET30，得到带有polh-AP融合基因片段表达载体pET-polh-AP，将该带有polh-AP融合基因片段表达载体转化表达宿主细胞，表达宿主细胞经培养，表达带有所述抗菌肽AP2的融合蛋白；

从BmNPV基因组中PCR克隆所述多角体基因polh，PCR克隆的正向引物为带Nco I酶切位点的5’-AACCCATGGATATGCCGGATTATTCATAC-3’，反向引物为带EcoR I酶切位点的5’-TCGTGAATTCATACGCCGGACCAG TG-3’；

所述表达宿主细胞为E.Coli BL21。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：培养所述的转入有上述表达载体pET-polh-AP的表达宿主细胞E.Coli BL21，直到菌液的OD600达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导重组蛋白polh-AP的表达，将诱导后的菌株离心收集，用pH为7.8的PBS进行重悬，再超声波破碎，把破碎后的菌液离心，收集不溶性包涵体，纯化收集重组蛋白样品。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：纯化收集重组蛋白样品的过程中，首先使用pH为9的PBS进行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集不溶性包涵体，然后将收集的不溶性包涵体继续用pH为12的PBS进行重悬浮，震荡溶解30min，离心收集溶解后的蛋白，将所得蛋白溶液的pH调节到7.8，室温静置2h，离心收集沉淀的蛋白质。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：将所得重组蛋白的浓度调整为15mg/ml，然后将该重组蛋白溶液与3倍体积的羟氨裂解反应缓冲液混合，55℃孵育24h,polh-AP融合蛋白裂解得裂解反应样品，将该裂解反应样品用20mM PBS透析、离心，获得AP上清，冻干保存。