[发明专利]利用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种利用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin和制备抗菌肽apidaecin的方法。

背景技术

抗菌肽是由生物体基因之间编码产生的一类能抵抗外界病原体感染的小分子肽，具有理化性质稳定、无免疫原性、抗菌谱广等特性，其抗菌活性和抗菌效应与抗生素非常接近，在替代抗生素方面显示了巨大的潜力。apidaecin是一类富含脯氨酸的抗菌肽，由于其独特的抑菌作用机制而备受关注，研究表明，apidaecin能特异地作用于革兰氏阴性菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌和乙酸钙不动杆菌等致病菌均具有普遍的杀伤作用。因此，apidaecin对解决因革兰氏阴性菌而导致的抗生素抗性危害不断加重的问题具有特殊意义。

目前，抗菌肽可通过以下途径获得：1、从生物体提取纯化；2、化学合成；3、基因工程，其中前两种方法由于成本和技术问题，不适于抗菌肽的工业化生产，基因工程方法是目前最有潜力的途径。Apidaecin已在多种不同的宿主中表达，如链霉菌、乳酸乳球菌等，这些制备apidaecin的方法普遍存在着表达量低、成本昂贵，无法达到实际应用的要求等问题。

杆状病毒表达系统自建立之后，就得到了迅速的发展和广泛的应用。与其他表达系统相比，杆状病毒表达系统具有以下特点：安全性好，表达产物后加工比较完全，可容纳较大的DNA片段，适合表达细胞毒性蛋白，最大的特点是外源蛋白表达量高，若以家蚕幼虫或蛹做为生物反应器，还有下列优点：

（1）蚕体中有多种天然蛋白保护剂，对表达产物有保护作用，与昆虫细胞内的表达相比，家蚕体内表达水平往往高出100-1000倍。

（2）家蚕遗传背景清楚，且饲养的成本低，桑叶饲养的家蚕仅0.5元/条，用家蚕生成外源蛋白容易产业化。

（3）利用家蚕作为生物反应器，具有我国资源优势和特色，容易形成自主产业。

（4）由于蚕蛹本身可以食用，所以家蚕作为生物反应器有望开拓新的应用领域，如口服药物，口服疫苗等，张耀洲等发现含有重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的蚕蛹经离心、脱脂、纯化、冻干之后，经剂型加工制成口服药。该药给药于白细胞缺少的动物模型或因化疗等原因造成的白细胞减少病人，有很强的生白效果，这些冻干蚕蛹蛋白质在对小鼠和猕猴的长短期毒理安全性试验中均未发现异常。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞内安全、高效地表达抗菌肽apidaecin的方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种产量高的抗菌肽apidaecin的制备方法。

本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种利用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）化学合成如SEQ ID NO.1所述的AP2基因，并在该AP2基因的5’端加上肠激酶酶切位点序列，并克隆入pFastBacHta，构建重组质粒pFast-His-AP2，该质粒表达His融合的AP2；

（2）将步骤（1）所得的重组质粒pFast-His-AP2转化BmDH10Bac感受态细胞；

（3）经蓝白斑筛选，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，抽提重组BmBacmid基因；

（4）将步骤（3）所得的重组BmBacmid基因转染BmN培养细胞并进行培养，培养过程中当观察到细胞感染时，将BmN培养细胞培养液离心收集感染上清，得到重组病毒；

（5）将步骤（4）所得的重组病毒上清继续感染BmN培养细胞，感染72小时候，分别收集感染BmN培养细胞和培养上清，将收集到的感染BmN培养细胞悬浮于昆虫细胞裂解液，冰上超声裂解，离心取上清得表达产物，该表达产物为带His融合的AP2融合蛋白。

上述方案中，蓝白斑筛选使用的培养基为含卡那霉素、庆大霉素、四环素的固体培养基。

本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：将按第一个技术方案所述的利用家蚕细胞表达抗菌肽apidaecin的方法制得的带His的AP2融合蛋白用His亲和层析进行洗脱纯化，洗脱液在肠激酶酶解缓冲液中透析过夜后，用5kDa的过滤膜浓缩，所得浓缩液中加入EK后再25℃酶切过夜，酶切溶液即为AP2的粗制品。

洗脱纯化过程中，在漂洗缓冲液中依次加入5mM、10mM和20mM的咪唑，使得洗脱液中咪唑的终浓度为400mM，层析过程中加入竞争性咪唑缓冲液可有效减少非特异性结合，提高层析产物纯度。