[发明专利]一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗。

背景技术

奶牛乳房炎（Bovine Mastitis）是危害畜牧业发展、食品安全的重大传染病，特别是近年来，随着环境的改变、抗生素的滥用，产生了多种耐药菌甚至出现了超级细菌，由细菌感染引发的奶牛乳房炎发病率和死亡率逐年攀升，严重危害了畜牧业发展和食品安全，进而危害了人类健康。因奶牛乳房炎造成的经济损失，美国每年达30亿美元、英国4亿美元，我国35亿元以上。奶牛乳房炎分为临床型和隐性型。临床型的症状为：乳区发热、肿痛，泌乳量减少，乳清性状发生改变，细菌数增多、体细胞增加，重者并发多器官衰竭甚至死亡。隐性型没有特异的临床表现，通过体细胞、产奶量及质量检测才能检出，但奶牛罹患率比临床型高得多，造成病原微生物的进一步播散，在一定条件下会转化成临床型，实际损失比临床型高得多。

引发奶牛乳房炎的病原菌均达140余种。据临床流行病学资料显示，我国奶牛乳房炎的病原菌以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌为主，占细菌感染的91.4%，其中大肠杆菌占30%。基于O抗原大肠杆菌可分为多个血清型，奶牛乳房炎可能由一种血清型的大肠杆菌引起的，也可能是由多个血清型的大肠杆菌的混合物引起的。

发明内容

本发明的目的是提供一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗。

本发明提供的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）EBMO9，简称菌株EBMO9，已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8532。

本发明还保护所述菌株EBMO9在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。所述奶牛乳房炎为大肠杆菌引起的奶牛乳房炎。所述大肠杆菌具体可为所述菌株EBMO9、大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895或大肠杆菌ATCC25922。

本发明还保护一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活后的菌株EBMO9。

所述“灭活后的菌株EBMO9”可通过将所述菌株EBMO9进行甲醛灭活得到。所述“灭活后的菌株EBMO9”具体通过如下方法得到：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到“灭活后的菌株EBMO9”（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

所述疫苗还可包括佐剂。所述佐剂可为SP01佐剂、SP02佐剂、铝佐剂或白花油佐剂。

所述SP01佐剂具体如下：溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.1g/100mL聚氧乙烯蓖麻油和0.1g/100mL聚醚多元醇。

所述SP02佐剂具体如下：溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.1g/100mL聚氧乙烯蓖麻油、0.1g/100mL聚醚多元醇和10μg/100ml细菌鞭毛。

所述铝佐剂具体可为氢氧化铝或磷酸铝。

所述疫苗具体可为如下疫苗-Ⅰ、疫苗-Ⅱ、疫苗-Ⅲ、疫苗-Ⅳ、疫苗-Ⅴ或疫苗-Ⅵ：

疫苗-Ⅰ：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到疫苗-Ⅰ（含1×10¹⁰个细菌/mL）；

疫苗-Ⅱ：取所述疫苗-Ⅰ，加入氢氧化铝并使其浓度为0.5mg/ml，得到疫苗-Ⅱ；

疫苗-Ⅲ：取所述疫苗-Ⅰ，加入磷酸铝并使其浓度为0.5mg/ml，得到疫苗-Ⅲ；