[发明专利]一种草莓细胞核悬液制备方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种适用于流式细胞仪分析的草莓细胞核悬液制备方法。

背景技术

 栽培草莓（Fragaria×ananassa Duch.），又名凤梨草莓，属蔷薇科草莓属多年生草本植物，果实颜色鲜艳、柔软多汁，富含糖、蛋白质、维生素和花青素等营养物质，是世界上广泛栽培的重要经济作物，为世界七大水果之一。普遍认为目前草莓栽培品种的遗传背景狭窄，新品种培育也因此受到限制。随着研究深入，使用流式细胞仪进行植株倍性鉴定、基因组大小测定以及细胞周期等应用和基础研究对拓宽草莓育种基础具有重要意义。而其中获得适用于流式细胞仪分析的草莓细胞核悬液成为其中关键技术。

草莓叶片含有多酚类、其他次生代谢物质，采用已报道的方法难以获得适用于流式细胞仪分析的草莓细胞核悬液，或相关方法繁琐、含有对人体有害的试剂，这些都阻碍了相关研究的进行。为了对草莓更深入的研究，必须找到一种高效、快捷而又经济的草莓细胞核悬液制备方法，这样才能更有利于草莓相关研究的开展。

发明内容

 本发明目的是提供一种适用于流式细胞仪分析的草莓细胞核悬液，该方法高效、快捷、经济。

 本发明采用的技术方案是：

 一种草莓细胞核悬液制备方法，步骤如下：

1）取草莓嫩叶50 mg，置于塑料培养皿中加入1 ml提取液，所述提取液主要由终浓度如下的组分组成：14.8g/L二水合柠檬酸三钠，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及体积浓度0.5%吐温20；

2）使用刀片在提取液中切碎草莓嫩叶，然后收集提取液经350 目尼龙网过滤，获得草莓细胞核悬液。

在步骤2）所述的草莓细胞核悬液中加入DNA荧光染料碘化丙锭( propidium iodide , 终浓度为50μg/ ml)， 及Rnase (终浓度为50μg/ ml)，染色后的提取液用于流式细胞仪的检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在于：

1）最大限度地减少了有害试剂的使用，如巯基乙醇，减轻了提取液对人体的危害；

2）提取液成分简单，只有三种，均为常规实验室试剂，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；

3）步骤简单，无需离心，节省了时间提高了效率，可以在短时间内获得细胞核悬液用于流式细胞仪检测；

4）可获得较高质量细胞核悬液用于流式细胞仪检测。

附图说明

  图1 采用本发明制备的草莓细胞核悬液流式细胞仪分析直方图；

  图2 采用两步法制备的草莓细胞核悬液流式细胞仪分析直方图。

具体实施方式

 下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此：

实施例1

  一、试剂的配置

 1）细胞核提取液配置：称取1.47g二水合柠檬酸三钠、1g聚乙烯吡咯烷酮K-30于一干净的250ml烧杯中，加入体积浓度0.5ml吐温20；加超纯水定容到100ml。用0.22微米滤膜过滤后4度保存备用。

 2）荧光染料配置：称取25mg碘化丙锭、25mg核糖核酸酶于一干净的250ml烧杯中加超纯水定容到50ml。用0.22微米滤膜过滤后4度保存备用。

  二、草莓细胞核悬液提取方法

（1）取草莓嫩叶（约50 mg），置于塑料培养皿中加入1 ml提取液。（2）使用锋利剃须刀片在提取液中切碎叶片；（3）收集提取液经350 目尼龙网过滤，获得草莓细胞核悬液；（4）过滤后的提取液中加入DNA荧光染料碘化丙锭（终浓度为50μg/ ml）及Rnase （终浓度为50μg/ ml）。染色后的提取液上流式细胞仪检测。

 草莓细胞核悬液的流式细胞仪检测

 采用过FACSCalibur 流式细胞仪（美国Becton-Dickinson 公司），在488 nm 激光的激发下发出桔红色荧光，由FL2 通道检测出荧光强度。从随机软件Cell Quest Pro获取数据,并通过ModFit LT软件显示直方图（横坐标以DNA相对含量反映荧光曲线的面积纵坐标为细胞核次数），结果见图1。本发明制备的草莓细胞核悬液不仅适用FACSCalibur 流式细胞仪，也适用于 Quanta SC（美国贝克曼库尔特公司） 等目前市场是所有具有488nm激光器的流式细胞仪。

 对比例1：采用已报道的两步法（Dolezel J , Gohde W. Sex determination in dioecious plants Melandrium album and M. rubrum using high-resolution flow cytometry. Cytometry , 1995 ,19 :103 - 106.）提取草莓细胞核悬液经流式细胞仪检测的直方图，结果见图2。荧光峰不明显，碎片较多，无法用于相关研究。