[发明专利]一种基于数字PCR平台检测基因点突变的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域和核酸检测领域，具体为检测基因点突变的方法及其试剂盒。

背景技术

点突变是基因变异中常见的类型，会给微生物、植动物的生物性状和人类的生理性状带来很多变化；包括蛋白质功能的部分或全部失活，形成无活性的片段等，也有可能改变生物体的基因调控等其他功能。基因突变的研究对生物的遗传、进化和改造具有重要意义。

目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger测序法）和ARMS法。现分别简介于下：

Sanger测序法，即Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长(一般需2－3天)且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%～20%以上的突变。

ARMS法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展。

ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及下游3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游5’端引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增突变型DNA模板。

上述现有技术存在以下问题：

1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测，或者定量分析误差较大。

2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。

3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。

发明内容

本发明旨在提供一种基于数字PCR平台检测基因点突变的试剂盒及方法。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入PCR引物和TaqMan探针，利用两条不同的TaqMan探针（标记不同类型荧光）对野生和突变DNA模板进行检测；根据荧光类型判断样品中DNA模板的类型。

本发明技术方案为，

一种检测基因点突变的方法，步骤包括：

1.将待测样品DNA模板、点突变位置的上下游PCR扩增引物、TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；