[发明专利]猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测试剂盒及其制备方法，特别涉及一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

猪病毒性腹泻的病原包括猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和猪轮状病毒（Porcine rota virus，PRV），其中PEDV在我国呈现爆发趋势。猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由PEDV引起的一种高致死率、急性、高度传播性的肠道疾病，该病以急性肠炎、呕吐、伴有脱水的水样腹泻为主要特征，各年龄猪均易感，尤其是哺育仔猪，发病率为100%，死亡率为80%-100%。近几年来，由猪流行性腹泻引起的爆发性疾病日渐增多，在2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后爆发了由流行性腹泻病毒引起的腹泻，该次发病流行范围广，流行时间长，死亡率高，给各地养殖户均带来重大的经济损失。

目前猪流行性腹泻疾病尚缺乏有效的针对性的根治手段，主要靠预防监控和隔离处理。在检测猪流行腹泻病毒方面目前主要通过病毒分离培养、间接免疫荧光、原位杂交以及聚合酶链式反应（PCR）等。这些方法都存在不同程度的耗时时间长、所需仪器昂贵等缺点，不便于普遍开展监测工作。目前基于免疫吸附原理的检测试剂盒由于具有方便快捷、操作简单和所需仪器简单的特点越来越受到研究者重视。现有的商品化检测试剂盒（我国尚无商品化检测试剂盒）以及相关专利均是以抽血检测抗体为共同特点，这种检测一方面存在从病原侵袭到抗体产生的滞后性，另一方面抽血也在一定程度上存在复发感染和传染的可能性，同时会对猪产生一定的应急，也会增加一定程度上的操作难度。另外，目前较多猪场均有针对性地进行灭活苗的免疫措施，这也会导致体内抗体的检测并不能说明是免疫后产生的抗体还是因为感染病毒后产生的抗体。

流行性腹泻病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，主要随呕吐物和粪便排出体内，因此本领域需要一种针对流行性腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV病原进行检测的试剂盒产生，以能够方便的从呕吐物和粪便中检测到PEDV，以便及早发现PEDV感染猪，同时降低检测的操作难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法，该ELISA检测试剂盒以腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV病原为检测对象，特异性卵黄多克隆抗体提高检测灵敏度，能够及早发现PEDV感染猪，避免PEDV抗体检测试剂盒的假阳性现象，同时降低检测的操作难度。

本发明提供以下技术方案：

在第一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、检测抗体和酶标二抗，其中所述酶标板上包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体，所述检测抗体为抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，所述酶标二抗为酶标记且抗检测抗体的抗体。

本发明的ELISA检测试剂盒包括酶标板、检测抗体和酶标二抗，酶标板上包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体用于特异性捕获腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV；检测抗体为抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，用于与被捕获的PEDV结合，并提供酶标二抗的结合位点；酶标二抗为酶标记且抗检测抗体的抗体，用于与检测抗体结合，并通过酶促发光显示信号。

作为ELISA检测试剂盒，酶标板、检测抗体和酶标二抗是其核心成分，只要有这三种成分就能实现基本的抗原-抗体结合反应。至于辅助成分，比如样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照，可以与上述三种成分配套组装在一个ELISA检测试剂盒中，也可以单独提供，因此本发明中ELISA检测试剂盒可以包括这些辅助成分，也可以不包括，本发明优选包括这些辅助成分，以方便使用。

本发明中，检测抗体可以是来源于各种哺乳动物的抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，比如来源于兔、鼠、羊、马或驴的抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，优选鼠抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体。

本发明中制备多克隆抗体的方法，是目前比较成熟的技术，具体地，可以用纯化的病毒或者重组表达的病毒蛋白免疫动物，分离血清或卵黄，并通过沉淀离心、层析等方法从血清或卵黄中提取抗体。本发明中的特异性卵黄抗体是将PEDV病原免疫蛋鸡后通过硫酸铵沉淀法和亲和层析方法得到。