[发明专利]一种检测TERT单核苷酸多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术分子检测技术领域，具体涉及一种检测TERT单核苷酸多态性的方法。

背景技术

膀胱癌是排在第九位的全球最常见的肿瘤。2013年,在美国有超过73000名患者被诊断为膀胱癌，其中死亡人数约15000人。其中超过90%的患者最初诊断为原发性膀胱癌，大约75%的患者目前为表浅膀胱肿瘤,20%的为浸润性膀胱肿瘤,剩下的5%初诊为转移性肿瘤。先前的研究表明,膀胱癌有着多变的临床表现和遗传背景。最近的膀胱肿瘤研究报道了8个相关基因(UTX,MLL-MLL3,CREBBP-EP300,NCOR1,ARID1A,CHD6)。

目前检测“膀胱癌”采用的肿瘤标记物主要有以下几种，但是各肿瘤标志物都存在不同的缺点：

(1)、膀胱肿瘤抗原(BTA)：BTA试剂分为BTA stat和BTA test两种；首先，这两种试剂都不能独立用于确诊膀胱癌；另外，BTA试剂价格昂贵，目前尚难以全面推广使用；

(2)、Lewis X抗原检测：Lewis X是一种ABO血型相关抗原，在正常尿路上皮中不存在该抗原；而5%～89%的移行细胞癌可检出Lewis X，但Lewis X与肿瘤的分级无关；

(3)、核基质蛋白22(nuclear matrix protein22，NMP22)：NMP22是核有丝分裂器蛋白，诊断膀胱癌的敏感性为48%～90%，特异性为70%～92%，NMP22对高级，高期膀胱癌敏感性较高；

(4)、纤维蛋白/纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDP)：用快速免疫检测法测定尿中FDP诊断膀胱癌的敏感性为68%，对T2～T4期膀胱癌的敏感性更是高达100%；

(5)、玻璃酸酶检测hyaluronidase,HAase：玻璃酸酶是一种细胞外降解基质透明质酸的内源性糖苷酶，在肿瘤进展中起重要作用，应用凝胶技术检测G2，G3级膀胱癌尿液中玻璃酸酶活性，敏感性达92%～100%；

(6)、端粒酶活性(telomerase)：端粒是位于染色体末端的保护性结构，随细胞分裂逐步缩短，直至细胞死亡，端粒酶的作用就是延长端粒，现已发现多种肿瘤细胞中端粒酶活性增强，该法诊断包括低级，低期肿瘤在内的膀胱癌，敏感性可达91%。

然而，导致膀胱肿瘤发生的关键点仍未完全阐明，同时由于这些个体标记的灵敏性较低以至于未被应用于临床实践中，这表明需要新的灵敏性高的生物标记及相应的检测技术。

发明内容

在PCR扩增时，引物的延伸是从其3'未端开始的，要求引物3'端的碱基与模板需严格配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去从而切割TaqMan探针的阻遏基因，产生可供检测的荧光信号。若引物3'端与模板不能配对，则引物的延伸被阻断，不能检测到相应的荧光信号，基于以上事实，利用3'端含突变碱基的引物进行TaqMan Probe Real time PCR扩增，可以检测靶DNA中有无相应的突变位点。针对一个特定突变位点的反应系统包含两个PCR扩增反应，分别设计两对3'端存在差异的引物，一为正常引物，另一为3'端突变的引物，正常引物与正常模板严格配对，PCR时扩增相应的产物，而突变的引物只与突变的模板扩增出相应的产物。用两对引物同时扩增突变和正常样品，可以得到不同的扩增循环数比值△Ct，通过对两对引物的扩增循环比值进行比较判定，可以确定被测样品中是否存在突变位点。

在本发明的试验过程中，在超过85%的人类肿瘤研究中发现端粒酶逆转录酶(TERT，TERT通过Human Genome Browser获取NCBI发布版本37的人类基因组序列：Feb.2009(GRCh37/hg19)；>hg19_ensGene_ENST00000310581_0range=chr5:1295163-12965625'pad=4003'pad=0strand=-repeatMasking=none)活跃,我们认为是一个人类肿瘤发生的重要机制。TERT是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂,在人类肿瘤中调节端粒酶活性。最近人们应用全基因组测序在黑素瘤中发现TERT启动子突变。人们在一些膀胱癌样本中证实了高频率的TERT启动子突变。一些研究发现,具有活性的端粒酶或TERT表达增加与肿瘤的病理分期以及临床分期是相关联的。然而,人们还未获得TERT基因拷贝，TERT的表达或活性对膀胱癌的临床影响仍然是有争议的。