[发明专利]一种用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料

权利要求书

1.一种用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，它是按以下方法制备的：

步骤一——化学萃取制备去细胞异体神经支架：在死亡不超过一小时的尸体切取周围神经，置入PBS液4℃保存8-12小时，然后取出，剪除周围神经干上附带的脂肪、筋膜及血管等结构，保留完整的神经外膜，在26-28℃环境温度下按以下步骤进行化学萃取去抗原处理：

⑴无菌蒸馏水中浸泡10-14小时；

⑵在5%Triton X-100溶液中振荡10-14小时；

⑶再次在无菌蒸馏水中浸泡3小时；

⑷在5%脱氧胆酸钠溶液中振荡10-14小时；

步骤二——培养自体脂肪干细胞作种子细胞：收集患者在清创手术中被清除的残碎组织，选取其中无严重病变的浅层脂肪组织，清除血管、包膜等结缔组织，PBS液反复冲洗，剪碎成1mm³大小组织块，PBS液冲洗后，0.1%胶原酶37℃培养箱中消化1小时，过滤后离心，重悬于DMEM/F12（1:1）进行培养，过滤；细胞计数后1×10⁵/ml接种于25cm²培养瓶内培养；待细胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞进行传代，利用直接免疫荧光标记法及流式细胞术检测脂肪干细胞相对特异分子E-cadherin、CD105、CD44、CD29，对分选确定为脂肪干细胞继续培养，传代；

步骤三——细胞因子诱导的组织工程生物材料体外构建：于普通6 孔板中，将步骤二培养扩增的自体脂肪干细胞放置于步骤一制备的去细胞异体神经支架上，细胞浓度为2×10⁵/ml，放置于5%CO₂、37℃培养箱中进行培养，融合；12 小时后翻转去细胞异体神经支架，更换脂肪干细胞悬液，再次置于5%CO₂、37℃培养箱进行培养，融合；然后在含有外源性许旺细胞源性神经营养因子的复合诱导液中诱导培养，每48-72小时更换一次复合诱导液，经26-30天完成诱导过程，即为可用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料。

2.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，尸体周围神经的取材优选股神经和坐骨神经。

3.根据权利要求2所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，周围神经取材规格为直径7mm-8mm，长度80-100mm。

4.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，步骤一制备去细胞异体神经支架的“无菌蒸馏水中浸泡→5%Triton X-100溶液振荡→无菌蒸馏水中浸泡→5%脱氧胆酸钠溶液振荡”四步程序重复进行共3次。

5.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，步骤三所用复合诱导液含有H-DMEM培养基、10%FBS、100ng/ml SDNF、10^-5M全反式视黄酸、200ng/ml Heregulin-β。

6.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，步骤三用作细胞因子的许旺细胞源性神经营养因子规格为5ml/500ml或10ug。

7.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，经步骤三培养完成的组织工程生物材料放置冻存液中依次经过4℃30分钟，-20℃2小时，-80℃，保存备用。

8.根据权利要求7所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，所述冻存液成分为：10%二甲基亚枫、10%胎牛血清、80%DMEM/F12。