[发明专利]一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，包括：

能够与miRNA形成三元杂交结构的组合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板，3-WJ引物由两部分序列组成：其5'端部分与目的miRNA3'端部分互补，3'端部分与3-WJ模板的中间段互补；3-WJ模板由三部分序列组成：其5'端部分与目的miRNA5'端部分互补，中间段与3-WJ引物3'端部分互补，其3'端部分为含核酸切口酶识别位点的SDA模板区域；

扩增底物，包括dNTPs混合物；

DNA分子机器工具，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板与目的miRNA杂交后触发DNA分子机器工具，产生SDA模板产物；

具有发卡结构的发卡分子H，能够与SDA模板产物相识别，在识别后杂交打开发卡结构；

具有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与被打开的发卡分子H相互补的序列；

以及DNA分子机器扩增反应缓冲液。

2.如权利要求1所述的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述3-WJ引物与3-WJ模板有5～7个碱基的互补，3-WJ引物：3-WJ模板的摩尔比为1:1；

发卡分子H与SDA模板产物互补，也与分子信标探针互补，该互补序列中含有Nt.BbvCI的酶切位点；发卡探针与分子信标的摩尔比为1:5；

DNA聚合酶与核酸切口酶的浓度为2.5U和0.8U。

3.如权利要求1所述的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液为：50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,100μg/ml BSA，pH7.9；反应体积为20μL，反应温度为37℃，反应时间为30min。

4.如权利要求1或2所述的基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

SDA模板产物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

发卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。

5.一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）通过核酸互补杂交，目标miRNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的三元杂交结构；

2）将三元杂交结构与扩增底物、DNA分子机器工具、具有发卡结构的发卡分子H、分子信标探针以及DNA分子机器扩增反应缓冲液混合；

3）在三元杂交结构存在的情况下，DNA聚合酶识别3-WJ引物与3-WJ模板的SDA模板区域形成的扩增起始位置，并进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，产生SDA产物，而三元杂交结构中的SDA模板区域继续被扩增；

4）扩增所获得的SDA产物触发打开发卡分子H构成杂交体，发卡结构H被打开后，暴露出的与分子信标互补的区域，从而破坏分子信标的茎环结构，分子信标与杂交体构成双链结构，其荧光恢复；而分子信标参与形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物与发卡分子H构成的杂交体再打开新的分子信标，以产生更多的荧光信号；

5）待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中miRNA的含量，在一定范围内，miRNA浓度越高，则荧光信号越强。