[发明专利]一种干扰TLR4受体的小RNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制TLR4受体的小RNA及其在制备治疗慢性疼痛药物的应用。

背景技术

慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一，其生理学特点是痛觉的反应性增高，主要表现为痛觉过敏(hyperalgesia)和超敏反应(allodynia)。此类疼痛治疗困难，主要是由于其机制不明。目前在治疗上，主要是以吗啡为代表的阿片类受体阻滞剂，但存在众多的副作用以及成瘾、耐受等反应，从而限制了其长期使用。因此，亟需一种治疗效果良好、作用时间长、副作用轻的新方法，达到长期、有效控制慢性疼痛的目的。

Toll样受体4(Toll like receptor4，TLR4)是Toll家族之一，是细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)胞内信号转导的重要通路，是LPS靶细胞膜上的跨膜受体和自然免疫系统主要的病原模式识别受体。TLR4具有细胞外亮氨酸重复区域和细胞内信号区域，胞外信号通过CD14激活TLR4，而活化的TLR4胞内与接头蛋白MyD88的TLR4受体域结合，通过MyD88死域(death domain)再与IL-1受体相关激酶(IL-1receptor associated kinase，IRAK)结合，导致IRAK的自身磷酸化，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNF-α receptor associated factor6，TRAF-6)，而后通过激活IKK使IκB家族α、β激酶活化，导致IκB家族的广泛磷酸化而降解，使NF-κB转位到胞核，其活性二聚体启动细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等)和辅助刺激分子CD80和CD86基因的转录、翻译，最终导致炎症因子释放（参见文献：Takeuchi O and S akira.Toll-like receptors:their physiological role and signal transduction system.Int Immunopharmacol，2001，1(4):625-635）。

TLR4受体在疼痛的发生、发展和维持中发挥重要作用。在L5神经损伤模型雄性大鼠模型中发现脊髓胶质细胞TLR4的高表达与神经损伤后痛觉超敏密切相关。L5神经切断后TLR4-knockout及TLR4基因突变小鼠热痛阈、机械痛阈明显高于野生小鼠；对雄性L5神经切断大鼠鞘内注射TLR4抑制性寡核苷酸（ODN）可降低脊髓胶质细胞激活相关标志及促炎因子的表达，明显减轻大鼠对痛觉的敏感性，在小鼠及大鼠模型证实TLR4在胶质细胞激活中的作用，为临床神经病理性疼痛的诊治提供了新靶点（参见文献：Tanga FY，Nutile McMenemy N，DeLeo JA.The CNS role of Toll-like receptor4in innate neuroimmunity and painful neuropathy.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(16)：5856-5861）。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因沉默的现象，是生物体内抑制特定基因表达的一种现象。外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA将被RNaseⅢ家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer，以ATP依赖的方式逐步切割为19～23nt的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs,siRNA)。siRNA双链在RISC作用下双链解开，同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断，从而阻断了基因表达。RNA干扰是目前最有效的基因“沉默”技术，从理论上讲，在疼痛通路中兴奋性增高的基因都可能成为RNA干扰靶位，从而降低其兴奋性，达到治疗目的。但是，干扰效率高，特异性强的小RNA的获得较难，不同序列的差异即可导致有效性的丧失，从而影响其药理学的价值，我们采用大鼠模型发现干扰大鼠TLR4受体的小RNA具有治疗疼痛的作用。（参见文献：吴飞翔，缪雪蓉，徐学武，孙玉明，俞卫锋.鞘内注射针对Toll样受体4基因的siRNA缓解坐骨神经结扎大鼠的神经病理性疼痛.第二军医大学学报.2011，32（4）：377-381）。但是，用于人体的治疗仍需要有效的干扰人源性TLR4受体的小RNA。

目前尚无有关干扰人源性TLR4受体的小RNA及其用于治疗慢性疼痛的文献报道。

发明内容