[发明专利]一种从血浆中提取人凝血因子Ⅷ的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备工艺，属生物制药领域。

背景技术

凝血因子Ⅷ是治疗甲型血友病唯一的特效药，在临床上有巨大的应用价值，病人由于凝血机制有缺陷，偶遇外伤往往流血不止，需要输入足量的凝血因子Ⅷ制剂，加上凝血因子Ⅷ在人体内的半衰期只有8～12个小时，虽然效果显著，但是不能持久，一旦患病，终身需要此药。虽然这类人人数不多，但是需求量大，所以在全球形成供不应求的局面。

出于对安全的考虑，我国尚无对血液进口解禁的打算，中国市场完全为国内生产商生产，均为从血液中提取，在现阶段研发出安全性高、产品比活性好、造价低廉的人凝血因子Ⅷ有着积极意义。

发展到现在，国内外已经有多种从血液中提取纯化因子Ⅷ的方法，现有的多步离子交换层析法虽然纯化率高，但步骤繁琐，需要耗费大量时间；近年来单克隆抗体技术的发展，免疫亲和层析法得到应用，但单克隆抗体造价昂贵，且稳定性较差，有可能对血浆造成二次污染，难以大规模的运用到工业生产中；肝素作为另一种亲和配基，可以利用静电和亲和相互作用分离血浆中很多凝血因子，肝素价格便宜，但亲和特异性差。本次技术方案采用先进行两次肝素钠洗涤法分离提取凝血因子，再用离子交换层析法进行针对性洗脱，纯化，以达到更好的效果。

发明内容

本发明的目的是提供回收效率和活性高，并且生产成本低的一种人凝血因子Ⅷ的制备工艺。

本发明的技术效果是通过以下步骤得以实现的：

1、将新鲜血浆进行一次沉淀：将新鲜冷冻血浆通过0～4℃水浴融化，并控制血浆温度在0～4℃，进行离心分离得到一次沉淀，离心时的进液速度≤2000mL/min，分离出液温度应不高于4.0℃；

2、将步骤1得到的一次沉淀进行悬浮：将一次沉淀粉碎投入溶解液，水浴至26.0～29.0℃，搅拌溶解0.5小时，用浓度为0.25～0.3mol/L盐酸调pH为6.80～7.00，调整后加入2500IU/L的肝素钠溶液，速度200～400mL/分钟，使之终含量为60IU/L，向溶液中以500～600mL/min的速度加入溶液A（含31.56%聚乙二醇3350，0.32％枸橼酸钠，用1.0mol/L盐酸调pH为6.20～6.60，温度25.0±5.0℃）使制品中聚乙二醇浓度达到3.0％～5.0％，用0.5mol/L的醋酸溶液（加液速度控制在小于200mL/min）调整制品pH至6.50±0.20，降温至10.0～20.0℃后反应30分钟，静置1～2小时；

3、将步骤2得到的悬浮液进行离心分离出上清液：虹吸静置后的制品上清液进行离心分离，出液速度控制在1000～1500mL/min，温度控制在12.0～18.0℃，收集离心出液，离心出液应澄清，使用0.15～0.45mol盐酸调整制品pH至7.00±0.20，过滤离心后的上清，过滤制品压力不得高于0.3Mpa，速度不得高于5.0L/分钟，检查出液应澄清，滤液温度12.0～18.0℃；

4、将步骤3中的上清液进行病毒灭活：根据过滤后制品体积加入10%S/D溶液，至终溶液含S/D浓度为1.2%，终溶液含Triton X-100为1.2%，含磷酸三丁酯0.4%；搅拌均匀后升温至23～25℃，连续搅拌3～5小时；

5、将步骤4灭活后的制品进行悬浮：灭活结束前使用平衡液（配方： 0.02mol/L三羟甲基氨基甲烷、3.5%的聚乙二醇3350，0.032%枸橼酸钠，pH为6.40～6.60）平衡装有澄清滤材的滤器及制品输送管道，将灭活后的制品澄清过滤入制作罐，滤液温度应在16～25℃。开启搅拌，搅拌转速控制在40～80转/分钟（频率为30%～50%），加入溶液III（配方：含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸橼酸钠， pH 5.60～5.80），添加速度在500～600mL/min，使制品中聚乙二醇浓度达到12.0±1.0％，加完后用0.5mol/L的醋酸溶液（加液速度控制在小于200mL/min）调整制品pH至5.80±0.10，再降温制品至7.0±2.0℃后搅拌反应30～60分钟，关闭搅拌静置60～90分钟；

6、将步骤5中的悬浮液进行离心分离出二次沉淀：离心分离蛋白沉淀，离心进出液速度控制在1000～2500mL/min，温度保持在6～9℃，收集沉淀，上清液废弃；