[发明专利]红花查尔酮异构酶CHI基因及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及红花查尔酮异构酶CHI基因及应用。

背景技术

    红花（Carthamus tinctorius L.）为一年生草本植物，属菊科植物的干燥管状花。红花具有活血通经，去瘀疗伤，宣毒透疹等功效，其主要有效成分为红花黄色素和红花红色素。红花黄色素为红花中多种水溶性查尔酮成分的混合物，不但是很有价值的食用色素，而且具有活血通络、消炎镇痛等功效，在血管性疾病、高血压、糖尿病并发症等发面亦有重要作用。查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI；EC5.5.1.6）是植物黄酮化合物合成途径中的关键酶之一，在黄酮化合物合成中将查尔酮异构化产生槲皮素。目前，国内外关于查尔酮异构酶的研究报道较多，主要集中在葫芦巴、青木香属、苜蓿、水稻、柑橘、桑树、金茶花、水仙、花生等多种作物中。但在红花中关于查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为提高植物中黄酮化合物含量，提供一种红花查尔酮异构酶CHI基因。

红花查尔酮异构酶CHI基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1或2所示；

一种表达载体，它插入了包括序列表SEQ ID No.2所示基因；

所述的表达载体，为pCAMBIA1304-bar，它是用bar基因序列替换了pCAMBIA1304中的潮霉素抗性基因的。

红花查尔酮异构酶CHI基因在培育高含量黄酮化合物转基因植物的应用。

本发明提供了红花查尔酮异构酶CHI基因，是以红花花瓣的RNA反转录的cDNA为模板，进行3’、5’race克隆，分别得到红花CHI基因的3’ 、5’端序列，通过拼接得到红花CHI序列，全长基因为1161bp，开放阅读框长度为654bp， 命名为ct-CHI，将其在ncbi上进行序列比对分析，发现该基因与青木香CHI基因的同源性达到82%，经实验表明，超表达ct-CHI基因能够促进黄酮的合成， ct-CHI基因被抑制后能够降低黄酮含量，在培育高含量黄酮化合物转基因植物方面具有广阔的前景。

附图说明

图1为红花花瓣RNA提取电泳结果图；

图2为CHI基因中间片段验证电泳图，其中，A:RT-PCR结果；B：菌液PCR；C：酶切图谱；

图3为 CHI基因中间片段验证电泳图，其中，A:CHI基因3'端PCR产物， B：CHI基因5'端PCR产物， C：CHI基因全长验证电泳图；

图4为红花CHI基因植物表达载体的构建图；

图5为红花CHI基因菌液PCR鉴定；

图6 为红花CHI基因酶切鉴定图；

图7为超表达 ct-CHI基因的转基因植株的黄酮含量对比；

图8为 RNAi干扰表达ct-CHI基因的转基因植株的黄酮含量对比。

具体实施方式

实施例1红花花瓣RNA提取

将红花“塔城红花”（购买于新疆塔城）种子播在装好砂的营养钵中，放在智能人工气候室中适当的条件下培养，采集红花花瓣。

1) 镊子、研钵、研棒和药匙用锡箔纸包好，放在180℃烘箱里干热灭菌4h，备用；

2) 1.5mL离心管、移液器吸头用0.1％DEPC水处理过夜，然后120℃高压灭菌20min，放置到60℃烘箱中干燥，备用；

3) 取红花花瓣约100mg，加入液氮迅速研磨至细粉，分装到两个1.5mLEP管中，各加入1mL RNAiso Plus后混合均匀，室温静置5min；

4) 4℃，12000rpm离心5min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；

5) 加入1/5 RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡，混匀，室温静置5min；

6) 4℃，12000rpm离心15min，取上清液转移到新的1.5mL离心管中；

7) 加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min；

8) 弃上清取沉淀，向沉淀中加入1mL 75%乙醇清洗沉淀，4℃，12000rpm离心5min，此步骤重复一次；

9) 弃上清保留沉淀，室温晾干；

10) RNA-Free水回溶RNA，提取的RNA保存于-80℃备用。

11) 红花总RNA样品浓度用NanoDrop2000超微量分光光度计(购自Thermo公司)测定。