[发明专利]克雷伯氏肺炎杆菌生产2R,3R-丁二醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产2R,3R-丁二醇的方法，特别涉及到一种克雷伯氏肺炎杆菌生产2R,3R-丁二醇的方法。

背景技术

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，用于生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻和2-酮基-D-葡萄糖酸等工业产品。

2,3-丁二醇是一种大宗化学品，其可用于合成塑料和橡胶等行业，同时也被认为是一种潜在的生物燃料，2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇由于凝固点较低，可用于防冻剂（Celinska E,Grajek W,Biotechnological production of 2,3-butanediol-Current state and prospects.Biotechnol Adv,2009,27,715-725）。2,3-丁二醇有两个手性碳，形成内消旋-2,3-丁二醇，2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇三种立体异构体。2S,3S-丁二醇和2R,3R-丁二醇是对映异构体，结晶点和沸点等性质相同。

有多种微生物可以合成2,3-丁二醇，其中多粘芽孢杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、克雷伯氏产酸杆菌和粘质沙雷氏菌具有较高的2,3-丁二醇生产性能，是具有工业应用前景的菌株。目前报道芽孢杆菌主要生成2R,3R丁二醇，伴随少量内消旋-2,3-丁二醇；而克雷伯氏菌属细菌主要生成内消旋-2,3-丁二醇并伴随少量2S,3S-丁二醇（Ui S,Masuda T,Masuda H,Muraki H,Mechanism for the formation of2,3-butanediol stereoisomers in Bacillus polymyxa.J Ferment Technol,1986,64,481-486）。

在克雷伯氏菌属中，2,3-丁二醇合成途径始于丙酮酸，两分子丙酮酸脱羧形成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸在脱羧酶的催化下脱羧形成R-乙偶姻（3-羟基-2-丁酮），乙偶姻在丁二醇还原酶的催化下消耗NADH形成内消旋-2,3-丁二醇。乙酰乳酸可以通过非酶催化形成双乙酰，双乙酰在丁二醇脱氢酶的催化下还原形成S-乙偶姻，S-乙偶姻进一步在丁二醇脱氢酶的催化下还原形成2S,3S-丁二醇（Xiao Z,Xu P,Acetoin metabolism in bacteria.Crit Rev microbial,2007,33,127-140）。

微生物生产的2,3-丁二醇是两种异构体的混合物，目前有相关报道利用基因工程菌株来生产单一立体构型的2,3-丁二醇。

在克雷伯氏菌属中，丁二醇脱氢酶由budC基因编码，该酶具有将乙偶姻还原成丁二醇的能力，也具有将双乙酰还原成S-乙偶姻的能力，其对底物的酮基还原后形成S构型羟基；因此该酶还原R-乙偶姻形成内消旋-2,3-丁二醇，还原S-乙偶姻形成2S,3S-丁二醇。通过在大肠杆菌中表达来源于克雷伯氏肺炎杆菌的丁二醇脱氢酶基因，同时表达解糖短杆菌的丁二醇脱氢酶，获得的工程菌株可以利用双乙酰生产2S,3S-丁二醇（Ui S.et al.,Production of l‐2,3‐butanediol by a new pathway constructed in Escherichia coli Lett.Appl.Microbiol.,2004,39,533–537）。

通过在大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脱羧酶基因，再表达枯草杆菌等来源的丁二醇脱氢酶基因，获得的基因工程菌株可以利用葡萄糖为碳源合成2R,3R-丁二醇（Yan Y,Lee C,Liao J,Enantioselective synthesis of pure(R,R)-2,3-butanediol in Escherichia coli with stereospecific secondary alcohol dehydrogenases.2009,Org Biomol Chem7,3914）。

目前并无利用克雷伯氏肺炎杆菌发酵生产2R,3R-丁二醇的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生产2R,3R-丁二醇的方法。通过该方法，能利用甘油为碳源发酵生产高光学纯度的2R,3R-丁二醇。

为解决上述技术问题，本发明中利用克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）生产2R,3R-丁二醇的方法，是在氧限制条件下，通过丁二醇脱氢酶酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌，以甘油为碳源，发酵生产2R,3R-丁二醇。