[发明专利]一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂；所述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体由1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到，所述1,5-脱水山梨醇免疫原的结构式如式（I）所示：

式中，R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n为1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。

2.根据权利要求1所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述的R为-(CH₂)₄-COO-；所述的载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。

3.根据权利要求1所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；所述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。

4.根据权利要求3所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与1,5-脱水山梨醇衍生物偶联形成，所述1,5-脱水山梨醇衍生物的结构式如式（II）所示：

R为-(CH₂)_n-COO-，n为1至20之间的整数。

5.根据权利要求4所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，R为-(CH₂)₄-COO-。

6.一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）权利要求4所述的1,5-脱水山梨醇衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；

（2）1,5-脱水山梨醇免疫原的合成：使1,5-脱水山梨醇衍生物的-(CH₂)_n-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；

（3）用1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物，制备并纯化抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体；

（4）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活1,5-脱水山梨醇衍生物，使G6PDH与1,5-脱水山梨醇衍生物连接，纯化连接产物；

（5）1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂A的制备：由抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体和均相酶底物混合而成；

试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。

7.根据权利要求6所述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，蛋白质载体为BSA，n=4，具体合成步骤如下：

1）将20mg BSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液PBS中，上述溶液置于烧杯A中；

2）将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg1,5-脱水山梨醇衍生物，0.35ml二甲基酰胺，0.35ml乙醇，0.7ml10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液，40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；

3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原，储存于-20℃。