[发明专利]双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，本发明涉及一种双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，以及其在介导对蝴蝶兰建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒（ORSV）的抗性中的应用。

背景技术

蝴蝶兰（Phalaenopsis ssp.）为兰科蝴蝶兰属花卉，于1750年最早被发现，迄今已发现七十多个原生种，在中国台湾和泰国、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚等地均有分布。蝴蝶兰因其花形优美，颜色华丽，为热带兰中的珍品，有“兰中皇后”之美誉，再加上耐贮运、宜于室内摆放、经济效益高等优点成为花卉业的新宠，蝴蝶兰盆花已成为全球重要的农业产业。近几年我国蝴蝶兰生产发展迅速，1997年大陆蝴蝶兰生产企业屈指可数，年上市量仅有20万株左右，而到2003年蝴蝶兰上市量超过1，000万株，产值达5亿元，2010年，我国蝴蝶兰年宵花上市量已达到2，610万株。

随着我国蝴蝶兰的大规模种植，病害也日趋严重。蝴蝶兰病毒病是蝴蝶兰上的一类重要病害，由于蝴蝶兰大多在生产上依靠组织培养进行无性繁殖，病毒在营养器官中不断积累，同时病毒还会通过组织培养和温室内植株管理造成的伤口进行传播，使蝴蝶兰病毒防治困难，严重影响蝴蝶兰的生长和观赏品质，并且欧美等国家对蝴蝶兰病毒检疫非常严格，带有病毒病的出口蝴蝶兰种苗和成品给我国出口企业造成巨大损失。目前生产上还没有有效的药物进行防治蝴蝶兰病毒病，只能通过淘汰病株和茎尖培养脱毒进行防治，但茎尖脱毒技术操作难度大，耗费大量的人力物力，脱毒效果有时并不理想，并且在扩繁和栽培过程中还会感染病毒，因此利用基因工程等技术选育蝴蝶兰抗病品种成为生产上的迫切需要。

目前，世界上已报导的兰花病毒有：建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒、建兰轻性花叶病毒、建兰环斑病毒、番茄环斑病毒、万代兰花叶病毒、石斛兰花叶病毒、洋兰斑点病毒和黄瓜花叶病毒等10来种病毒，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）发生最为普遍。建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒是侵染蝴蝶兰的两种主要病毒病原。

CymMV隶属线形病毒科、马铃薯X病毒属，线状粒子长475nm～490nm、直径13nm。ORSV隶属烟草花叶病毒属，杆状粒子长300nm、直径18nm。两种病毒可单独侵染或复合侵染兰科植物，引起花叶、坏死、叶脉褪绿、条斑等症状，复合侵染时可导致植株矮化，叶片畸形等重症，造成蝴蝶兰、石槲兰、大花惠兰、文心兰等多种热带兰及国兰产生严重病害，大大降低兰花的商品价值。我国报导兰花病毒始于1983年朱本明等从上海的兰花上分离到两种病毒，鉴定为建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。沈淑琳（1990）对这两种病毒的生物、生化特性进一步系统研究，证实是我国兰花上最主要的病毒。

蝴蝶兰病毒主要通过介体或汁液传播。介体是重要的传播途径，可通过蚜虫、线虫、螨类等进行传播。汁液传播是通过叶片的相互摩擦，或人的组织培养和田间作业，使健康叶片造成微伤，导致病毒传播。通过上述两种途径使蝴蝶兰感染病毒，并通过组培扩繁传至下一无性世代，从而在蝴蝶兰营养体中长期积累，导致产量和品质下降。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是最近几年发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术。是一种双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。不同的有机体，包括植物、果蝇、线虫及一些哺乳动物大多能利用RNA干扰机制来抵御病毒及其他外来核酸的侵人。提示它可能是生物体的一种进化保守机制。同时也可能成为特异性沉默内源基因和基因功能分析的一个革命性工具。