[发明专利]利用QCM传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用QCM传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片。

背景技术

玉米褪绿斑驳病毒(Mazie chlorotic mottle virus，MMCMV)是正单链RNA，其为直径30nm二十面体，它属于玉米褪绿斑驳病毒属，番茄丛矮病毒科的一员。它严重危害小麦、大麦、高粱、燕麦等多达15-19种禾本科植物的生长。玉米褪绿斑驳病毒广泛分布于阿根延、美国等欧美国家以及非洲的5个国家，由于其分布广泛，传入我国的的风险逐步加大。如果田间发现有病植株后，其可经昆虫介体、种子携带等方式快速传播，诱发大面积玉米发病，玉米叶片会出现褪绿斑驳等症状，从而导致严重的经济损失。

现阶段玉米褪绿斑驳病毒的主要检测方法有ELISA、实时荧光RT-PCR等。这些传统的方法在检测MMCMV时都有一定的缺陷，ELISA操作复杂，耗时长，检测结果受到实验用品、操作过程等影响；实时荧光RT-PCR易产生污染影响实验结果。随着技术的发展，石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）以其无标记、高灵敏度且快速的优点作为生物传感器越来越多的应用于疫病的检测中。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备用于检测病毒的QCM金片的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；

2）将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的QCM金片。

上述方法中，QCM金片为单侧镀金片，12mm×20mm，单侧镀金50nm，BioNavis公司，货号QSX301-Au-13052。

步骤1）中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备：将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中；

步骤1）中，所述浸泡为4℃浸泡12h；

步骤2）中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗病毒抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过酰胺键连接。

上述方法中，

步骤1）中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比为1:1-1:10，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比具体为1:1、1:5或1:10。

上述方法中，

所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比为1:10。

上述方法中，

所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9mM；

所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9mM。

上述方法中，

步骤2）中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片按照如下方法制备：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液活化所述修饰后金片表面的巯基十一酸和3-巯基丙酸的羧基基团；再滴加所述抗病毒抗体，以固定抗体；再将BSA封闭，得到用于检测所述病毒的QCM金片；

步骤2）中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片具体按照如下方法制备：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修饰后金片表面，常温（25℃）下静置2小时；再滴加所述抗病毒抗体，37℃反应3小时；再滴加浓度为1mg/mL BSA，25℃下静置1小时，得到用于检测所述病毒的QCM金片；

含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）和Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）的溶液：用分析天平称取一定量的EDC和Sulfo-NHS溶于100μL MES溶液，振荡均匀，使EDC在溶液中的浓度为表2所示，NHS在溶液中的浓度为表2所示。现用现配。

MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：称取3.90g MES溶于180mLddH₂O，调节pH至5.0，定容到200mL。

所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩尔比为4-5：1；

所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩尔比具体为5：1。

上述方法中，

所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC的终浓度为0.075M，且Sulfo-NHS的终浓度为0.015M。

上述方法中，

所述抗病毒抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述抗病毒抗体具体为单克隆抗体；

所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。