[发明专利]枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）EJPFPb及其编码基因改善烟草（Nicotiana tabacum）糖水平的方法。

背景技术

糖酵解是调控植物糖代谢的最重要途径。糖酵解途径有三个限速位点，这三个位点分别是由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶这三种酶作用。这三种酶催化的反应都是不可逆反应，因此这三种酶是糖酵解的限速酶。其中，磷酸果糖激酶是一类激酶，可作用于果糖-6-磷酸，反应产物为果糖-1,6-二磷酸或果糖-2,6-二磷酸。植物中的磷酸果糖激酶分为两种，一种是依赖ATP的ATP:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(ATP:Fru-6-P 1-phosphotransferase，EC 2.7.1.11)，简称为ATP-PFK；另一种是依赖焦磷酸的焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(pyrophosphate:Fru-6-P 1- phosphotransferase, EC 2.7.1.90) ，简称为PFP。PFP通常由α和β两个亚基组成，这两个亚基由不同的基因编码，α亚基具有调节活性功能，而β亚基具有催化活性。研究表明，通过调控PFP基因的表达，可以调节植株组织中的糖水平，例如，在甘蔗中下调PFP基因表达使蔗糖水平提高，果糖水平下降（Groenewald et al. Transgenic research，2008，17：85–92；van der Merwe et al. Planta，2010，231：595-608）。糖是水果风味的重要组成物质，其中果糖对风味构成起更为关键的作用，因此，如能通过PFP基因实现对糖组成及糖水平的调控，可为水果风味的改善提供技术依据；糖类与烟草的品质关系密切，是影响烟草吸味的最重要化学组分之一，对烟气的酸碱平衡和焦油含量有直接影响，无疑，利用PFP实现烟草糖分的调控，对改善烟草品质是有益的、可行的，但至今未见相关的资料报道和新植株问世。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法。

解决上述技术问题采用如下技术方案：

本枇杷EJPFPb及其编码基因改善烟草糖水平的方法按如下步骤进行：

（1）分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列：提取枇杷叶片总RNA，反转录合成cDNA，通过与GenBank已知的植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶pyrophosphate:Fru-6-P 1- phosphotransferaseβ亚基序列进行比对设计简并引物，利用反转录PCR获得扩增产物，扩增产物经琼脂糖凝胶回收，回收产物克隆到pMD18-T载体中并测序，利用分子生物学工具分析测序结果，与其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因比对，确定为枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因EJPFPb的保守区片段；

（2）分离克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全长序列：根据上述枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因cDNA片段序列设计引物，通过cDNA末端快速扩增技术获得基因的全长cDNA序列，与其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基基因比对，通过分析基因编码区及焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基特有的功能域确定分离到枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶β亚基全长cDNA序列，并命名为EJPFPb，EJPFPb基因编码区核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示；

（3）枇杷EJPFPb基因双元表达载体的构建：根据上述基因EJPFPb的完整编码区设计引物，进行PCR扩增，利用无缝克隆技术将扩增产物与经过酶切的植物表达载体pCAMBIA-1302进行连接，将EJPFPb正向插入pCAMBIA-1302，获得植物过量表达重组双元表达载体，命名为pCAMBIA-1302-EJPFPb；

（4）烟草的遗传转化:将上述表达载体pCAMBIA-1302-EJPFPb利用农杆菌介导法转化烟草，获得具有特异抗生素抗性的转基因植株，提取转基因植株叶片DNA，利用特异引物进行PCR扩增鉴定，确定成功获得转基因植株，单株收种子，对其后代进行观察鉴定;