[发明专利]一种基因C型鸭甲肝病毒的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及一种能够治疗鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法及制备抗体的用途，属于基因C鸭病毒性肝炎防控领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）引起的一种主要危害3周龄以内雏鸭的急性、高度致死性传染病。DHV包括小RNA病毒科和星状病毒科成员，而小RNA病毒科的DHV又被命名为鸭甲肝病毒(duck hepatitis Avirus,DHAV)，根据基因型结构的差异，DHAV又分为基因A型（DHAV-A）、B型（DHAV-B）和C型（DHAV-C）三种基因型。其中在我国流行的传统Ⅰ型DHV为基因A型DHAV，台湾地区新发的为基因B型，而近年来，韩国样新型或称基因C型的DHAV在我国的地区分布已较为广泛，基因A型和C型DHAV在我国许多养鸭地区的同时流行是我国许多鸭场针对传统的Ⅰ型DHV采取措施后仍发生DVH的根本原因。

然而，目前还没有单克隆抗体用于基因C型DHAV检测及治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）合成多肽TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR，NLFESKLTPY，TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI,SSFKQDVMDQ,MDQIQSPSTV，PVLEIQPWGV，GVARMRAYTA，每条多肽的C-端加上半胱氨酸残基；

（2）将上述多肽混合并与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原；

（3）将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠：抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫1次，抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫一次，第4次增强免疫注射抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合；

（4）杂交瘤细胞株的制备与筛选：按常规的细胞融合技术融合：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养；以步骤（1）合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%，获得稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株；

（5）取6～8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，-80℃冻存得到单克隆抗体的粗品；

（6）粗品经纯化得到单克隆抗体，所述单克隆抗体为分子量为50KD左右为重链蛋白与分子量为25KD左右轻链蛋白的组合，为IgG2亚类。

采用本发明的方法所制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可以广泛应用于鸭甲肝病毒的治疗。

微生物信息

杂交瘤细胞株5E3-9保存在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCC NO.C2013135，保藏日期为2013年10月30日。

附图说明

图1：DHAV-C与5株单抗的Western blotting杂交结果：M:蛋白分子量标准;1:5H24-9单抗;2:3E18-4单抗;3:5E3-9单抗;4:5C20-9单抗;5:5N20-8单抗；（代号没有特殊意义，只是筛选单抗过程中区分的标识）

图2：基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体特异性的鉴定：A:DHAV-A与5株单抗的Western blotting杂交结果；B:DPV与5株单抗的Western blotting杂交结果；C:NDV与5株单抗的Western blotting杂交结果;D:AIV与5株单抗的Western blotting杂交结果；M:蛋白分子量标准;1:5C20-9单抗;2:3E18-4单抗;3:5E3-9单抗;4:5H24-9单抗;5:5N20-8单抗；

具体实施方式

实施例1

1.1抗原制备

合成TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR，NLFESKLTPY，TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI,SSFKQDVMDQ,MDQIQSPSTV，PVLEIQPWGV，GVARMRAYTA，每个多肽合成500μg。