[发明专利]一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法，是一种高效、快速、低成本、操作简便的高通量蔬菜单粒种子DNA提取方法。

背景技术

分子生物学技术已经渗透到生物学、医学、植物学、遗传学和动物学等各个方面。植物DNA的提取是进行分子分析的最基本步骤，在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，所提取出的DNA质量的好坏将直接关系到后期分子生物学试验研究的成败。基于PCR技术的分子标记已广泛地运用于种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。其中以PCR技术为基础的标记如简单重复序列标记(SSR标记或微卫星标记)，由于其具有多态性好、可靠性高、技术简单、价格便宜和DNA模板使用量低等优点，在分子生物学中得到了广泛的应用。长期以来，单粒种子样本中DNA的提取一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。因此，许多学者一直在探索蔬菜单粒种子DNA的高通量快速提取方法。

目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多，主要有传统法、螯合树脂法、磁珠法、免疫亲合法等。

（1）传统法通过CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）或SDS（十二烷基硫酸钠）裂解细胞，酚/氯仿等有机溶剂抽提蛋白，能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA，获得的DNA纯度高，含量多。但比较费时，需要5小时甚至更多，流程繁琐，同时样品需要4-5个EP管，容易造成混淆和污染，操作复杂。而且提取过程中使用了大量的有机溶剂，有损实验人员的健康。

（2）磁珠法靠磁珠吸附、磁场分离提取DNA，适用于冰冻、陈旧组织，简单、快速整个过程仅需不到2小时，利用磁场分离可以得到较纯的DNA，但产量比传统法获得的少，且成本较高。

（3）免疫亲合法通过抗原抗体反应来提取DNA，适用于样本含量很少的标本，获得的DNA纯度高，含量多。缺点是设备要求比较高，不易普及，而且抗DNA单克隆抗体制备是关键步骤。

（4）螯合树脂法使用Chelex-100树脂来提取DNA，据报道该方法目前用于细菌、血液及部分病毒核酸提取，操作简单、快速、且成本不高。同时避免使用酚氯仿等有机溶剂，对操作人员没有损害。

Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解，并提高PCR扩增成功率。1989年Singer.Sam等最先报导了用Chelex-l00法提取组织培养细胞DNA，1991年Walsh等系统的研究了该方法在多种法医生物检材中的具体应用。目前Chelex-100法已经逐渐扩展到其他学科，用此法提取的DNA操作简便，并可以减少提取过程中DNA的损失，常用于十分微量的样品中（如毛发、血液、精斑和上皮脱落细胞中等）中提取足量的DNA。本发明利用Chelex-100对单粒种子破壳发育至初期幼苗的新鲜单株样品进行高通量快速提取，提高了育种产业品种选育和纯度鉴定过程的检测效率。

发明内容

本发明的目的在于克服传统样本DNA提取步骤多、复杂、费时等缺点，公开了一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法。本发明的DNA提取方法具有高效、快速、低成本、操作简便等优势。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：

（1）取待测植物样本100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；

（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；

（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。

本发明所述的待测样本为植物样品包括花椰菜、大白菜、黄瓜、芹菜等各类蔬菜植物样品。本发明所述的待测样本为植物种子破壳发育至初期幼苗的新鲜单株样品。