[发明专利]LAMP1红色荧光表达载体、其制备方法及应用

说明书

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，涉及重组表达载体的构建，具体涉及一种LAMP1红色荧光表达载体、其制备方法及应用。

【背景技术】

溶酶体（lysosome）是真核细胞中由单层脂蛋白膜包绕的含一系列酸性水解酶的小体，是细胞内吞、细胞自噬两条代谢途径的共同终点。溶酶体既能通过与吞噬体融合，酸化水解通过细胞内吞途径进入细胞的生物大分子物质，调节细胞水平的信号传递；又能通过与自噬体融合，降解通过自噬途径包裹到自噬体中的细胞器和内源性生物大分子，为细胞提供生物合成的新原料。通过荧光显微技术观察溶酶体的亚细胞定位对于研究细胞内吞、细胞自噬两条代谢途径意义重大。传统的应用于观察溶酶体的方法主要是免疫荧光染色和电镜观测两种方法，其中，免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体），在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量，使用抗体将溶酶体体特异性表达的蛋白质LAMP1上标记上荧光信号，可以用荧光显微镜下或激光共聚焦显微镜观察溶酶体的亚细胞定位；而电镜是利用电子与物质作用所产生之讯号来监定微区域晶体结构，微细组织，化学成份，化学键结和电子分布情况的检测手段。使用电镜技术通过观测细胞切片或组织切片中细胞微细结构，依据形态可鉴别溶酶体。

以上两种方法中，使用免疫荧光鉴定溶酶体依赖于高效价的LAMP1抗体，这样不仅步骤繁琐，而且实验成本高；而用电镜法鉴定溶酶体体，依赖于研究人员丰富的形态学分析经验，难度比较大，不易于普及；而且上述两种方法都需要先将细胞固定灭活后，再检测，无法进行活细胞观察。

【发明内容】

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种LAMP1红色荧光表达载体，解决现有技术中溶酶体靶细胞定位检测中步骤繁琐、实验成本高以及无法进行活细胞检测的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的方案如下：

一种一种LAMP1红色荧光表达载体，表达LAMP1和红色荧光蛋白的融合蛋白，所述表达载体以pmCherry-c1载体为骨架载体，在pmCherry-c1载体多克隆位点融合了LAMP1编码基因。

优选地，所述LAMP1编码基因位于pmCherry-c1载体的EcoR I/BamH I之间。

优选地，所述表达载体的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：5。

本发明还提供了一种制备LAMP1红色荧光表达载体的方法，包括如下步骤：

步骤1：用人类子宫颈癌细胞Hela细胞的cDNA作为模板进行PCR扩增，获得含有EcoR I和BamH I酶切位点的LAMP1DNA片段，其中，所述PCR扩增引物为序列表中的SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；

步骤2：将所得LAMP1DNA片段和pmCherry-c1载体分别用EcoR I和BamHI进行双酶切，得到LAMP1基因和酶切后的pmCherry-c1载体；

步骤3：将所得LAMP1基因和酶切后的pmCherry-c1载体用DNA连接酶进行连接，得到pmCherry-c1-LAMP1载体。

优选地，所述步骤1中PCR扩增的反应条件为：起始98℃5min；然后98℃10s，58℃30s，70℃2min，进行35个循环；最后72℃10min。

优选地，所述步骤2中LAMP1基因和酶切后的pmCherry-c1载体的质量比为2.5:1-5:1；所述步骤2中所用的DNA连接酶为T4DNA连接酶。

优选地，所述步骤2和所述步骤3之间还包括如下步骤：

将所得LAMP1基因和酶切后的pmCherry-c1载体进行纯化。

本发明还提供了用上述的表达载体转染的细胞，其中，所述细胞为真核细胞。

本发明还提供了一种细胞检测试剂，包括上述的表达载体。

本发明另外还提供了上述的表达载体或上述的细胞检测试剂在检测溶酶体在靶细胞中定位的用途。