[发明专利]一种产孢真菌菌种长期保藏的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产孢真菌菌种长期保藏的方法。

背景技术

目前，产孢真菌菌种保藏有以下方法：1）定期传代保藏法；2）液体石蜡保藏法；3）滤纸片保藏法；4）生理盐水保藏法；5）自然基质保藏法（麦粒保藏法，麸曲保藏法）；6）干燥保藏法（沙土管保藏，冷冻真空保藏）；7）冷冻保藏（液氮-196℃或超低温冰箱-70℃～-80℃）。以上方法在微生物及产孢真菌菌种保藏起着重要的作用，但有的保藏时期短、有的操作过程复杂、有的需要专用设备等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产孢真菌菌种长期保藏的方法，该方法操作步骤简单、保藏菌种成本低。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种产孢真菌菌种长期保藏的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将玻璃纸、培养皿、离心管以及真菌培养基进行灭菌，备用；

2)灭菌后，冷却到50℃，真菌培养基分到平板，待真菌培养基冷却至室温后，将玻璃纸平展放在真菌培养基上；

3）在玻璃纸上接种产孢真菌，28℃培养4-5天；

4）将玻璃纸从真菌培养基上取岀，放入培养皿中，盖上培养皿盖，放入28℃培养箱中，干燥3天；

5）将玻璃纸放入离心管中；

6)将离心管直接放入-80℃冰箱进行保藏。

上述一种产孢真菌菌种长期保藏的方法，其特征在于具体步骤如下：

1）将具有半透膜特性的常规的玻璃纸剪裁成3平方厘米，放入直径9厘米的培养皿中，50个1.5毫升离心管放入500毫升烧杯中，同配制的真菌培养基在121℃灭菌20分钟，备用；

2)灭菌后，冷却到50℃，真菌培养基分到平板，每个平板到15毫升，待真菌培养基彻底冷却后（即冷却至室温），用无菌镊子（酒精灯火焰灭菌）将玻璃纸平展放在真菌培养基上；

3）在玻璃纸上接种产孢真菌，28℃培养4-5天后，在玻璃纸上，产生大量菌丝和孢子；

4）用无菌镊子（酒精灯火焰灭菌）将带大量菌丝和孢子的玻璃纸从真菌培养基上取岀，立即放入无菌的不含真菌培养基的直径9厘米的培养皿中，并用无菌剪刀（酒精灯火焰灭菌）将玻璃纸剪裁成3个0.9-1.1平方厘米，盖上培养皿盖，放入28℃培养箱中，干燥3天；

5）3天后（是指上述干燥3天后），用无菌镊子（酒精灯火焰灭菌）将上述0.9-1.1平方厘米玻璃纸放入1.5毫升无菌离心管中，每个离心管放一片玻璃纸（共3片，3个离心管），盖上盖子、用封口膜封口并做好标记；

6)将以上离心管直接放入-80℃超低温冰箱进行长期保藏。

所述的产孢真菌为哈茨木霉菌、棘孢曲霉菌、青霉菌、脉孢菌、黑曲霉菌、绿色木霉菌、根霉菌、毛霉菌等中述任意一种。

所述的真菌培养基自选用下述任意一种：

（1）马铃薯培养基（PDA）的组成：马铃薯（去皮）200.0g、蔗糖20.0g、琼脂粉18.0g、水1000.0ml；

马铃薯培养基（PDA）的制备：将马铃薯去皮，切成小块，于锅中加自来水1000mL煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加蔗糖后再加琼脂粉，并加水补足1000mL，pH自然，121℃灭菌20分钟，得到马铃薯培养基（PDA）。

（2）蔗糖硝酸钠培养基（察贝壳培养基）的组成：蔗糖30.0g、硝酸钠2.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂粉18.0g、蒸馏水1000mL；

蔗糖硝酸钠培养基（察贝壳培养基）的制备：将蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、琼脂粉和蒸馏水混合，调节pH7.0，121℃灭菌20分钟，得到蔗糖硝酸钠培养基（察贝壳培养基）。

（3）马丁培养基的组成：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、琼脂粉18.0g、蒸馏水1000mL；

马丁培养基的制备：将葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂粉和蒸馏水混合，pH自然，121℃灭菌20分钟，得到马丁培养基。

（4）豆芽汁蔗糖培养基的组成：黄豆芽20.0g、蔗糖20.0g、琼脂粉18.0g、水1000.0mL；

豆芽汁蔗糖培养基的制备：先将黄豆芽洗净，放入1000.0mL水中煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加蔗糖后再加琼脂粉，并加水补足1000mL，调节pH7.0，121℃灭菌20分钟，得到豆芽汁蔗糖培养基。

选择适合培养产孢真菌的真菌培养基。