[发明专利]抗中国东亚钳蝎蝎毒F(ab’)2抗体制备及其使用方法

权利要求书

1.一种抗中国东亚钳蝎蝎毒F(ab’)₂抗体，其特征是，

其分子量为：97000～110000Da

其理化性质为：白色或淡黄色疏松体，注射用水或生理盐水溶解后ｐＨ值在6.0～7.0之间，能与抗马血清或ＩｇＧ反应呈阳性

其F(ab’)₂抗体纯度大于85%，ＩｇＧ含量低于5％

所述抗体具有如下功能：

与山西产BMK蝎毒在2:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；

与辽宁产BMK蝎毒在0.5:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；

与山东和河南产BMK蝎毒在1:1(M:M)时可保护小鼠100％存活。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征是，免疫扩散测定该抗体冻干品与山西、山东、河南和辽宁产东亚钳蝎蝎毒质量比在0.4:1时能出现清晰免疫沉淀线；各检测项符合2010年《中国药典》蛇毒抗血清质量标准。

3.权利要求1或2所述任何一项抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）从至少三个产地获取东亚钳蝎，采集它们的蝎毒，混合后作为免疫原，免疫动物后取动物血液，得到具有特异性IgG的蝎毒免疫血浆；

（2）取蝎毒免疫血浆，通过硫酸铵分步盐析获得IgG组分；

（3）用无菌水补IgG溶液至原血浆体积，HCl调pH值，加入胃蛋白酶酶解IgG后再加入硫酸铵，待完全溶解后于57℃保持15～20min，分离上清液；

（4）上清用Sephadex G25树脂色谱柱脱盐，再用1mol/L的Tris-HCl调节电导率值到2～3ms/cm后，上预先用pH8.0的0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose FF柱，上柱后用pH8.0的0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液淋洗1-3倍柱床体积，再用0.1mol·L^-1Tris-HCl+0.5mol·L^-1NaCl缓冲液进行线性梯度洗脱，0%→100%，3倍柱床体积，收集穿透峰洗脱液，脱盐过滤冻干即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，其中步骤（1）中所述三个产地选自山西，辽宁，山东，河南的任何一个。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是三个产地选自山西：山东：河南，采集三个产地的东亚钳蝎蝎毒的比例是3:1:1。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，

其中步骤（2）中所述通过硫酸铵分步盐析获得IgG组分；步骤如下：

血浆中加入硫酸铵使硫酸铵浓度为0.55g﹒mL^-1，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，以无菌水溶解后，加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为0.30g﹒mL^-1，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，加入无菌水溶解，使用Sephadex G25树脂色谱柱脱盐，获得IgG组分。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，

其中步骤（3）中所述方法如下：将IgG组分用无菌水补体积至原血浆体积，加入0.2mL甲苯使甲苯终浓度为2μg﹒mL^-1，以6mol·L^-1盐酸调pH值至3.0～3.5，按每1000mL加入胃蛋白酶0.1g的比例加入胃蛋白酶，置30℃水浴2.5～3.5hr，然后以5mol·L^-1氢氧化钠调pH值至5.0，置57℃保持30min，待温度降至45℃以下后离心，上清为抗体粗品。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，

其中步骤（4）为纯化步骤，收集穿透峰洗脱液后，经过Sephadex G-25柱或8000-10000Da超滤膜超滤脱盐后0.22μm膜过滤除菌、冻干，获得F(ab′)₂冻干品。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是该抗蝎毒血清DEAE-Sepharose FF柱层析结果经活性和纯度检测，活性集中在穿透峰上，F(ab’)₂SDS-PAGE纯度大于85%；小分子杂蛋白质集中在小分子杂蛋白集中在洗脱峰上。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述方法步骤如下：

（一）免疫及免疫血浆采集

按3:1:1比例分别称取山西、山东和河南产BMK蝎毒适量，0.9%氯化钠注射液溶解后配制成10mg·mL^-1溶液，0.22um滤器过滤后与弗氏佐剂等量混合，利用乳化器进行充分乳化，然后采用背部皮内多点注射法进行马匹免疫，首次免疫剂量蝎毒1.0mg/匹；此后每间隔2周加强免疫1次，每次剂量递增0.5mg，每次免疫完成两周后从颈静脉采血10mL，并用酶联免疫吸附方法测定血浆效价，血浆ELISA效价达到10^-6稀释为阳性时可进行采血，每匹马采血2000～4000mL，加入柠檬酸抗凝剂，使终浓度为5mg﹒mL-1，5000rpm4℃离心30min，取上层血浆，保存于-20℃，累积几次血浆后，混合并制备，

（二）盐析获得IgG组分

在马血浆中缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵终浓度为0.55g﹒mL^-1，该过程在缓慢搅拌条件下进行，搅拌1h后8000rpm室温离心30min，弃上清保留下层沉淀，加入原血浆等体积的注射用水，再次在缓慢搅拌条件下缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵终浓度为0.30mg﹒mL^-1，搅拌20min后同前条件离心，取沉淀加入适量无菌水溶解，使用Sephadex G25树脂色谱柱脱盐，收集蛋白峰即为IgG，

（三）酶解

制备的IgG用无菌水补体积到原血浆体积，先加入甲苯，使终浓度为2μg﹒mL^-1，再加入6mol﹒L^-1的HCl溶液调节pH值至3.2，加入Sigma公司，比活1：3000的胃酶30℃酶解2.5h，加入5mol﹒L^-1的NaOH溶液调节pH值至5.2终止反应，溶液57℃保温20min，然后使温度自然下降到45℃以下，8000rpm室温离心30min，得上清，

（四）纯化

使用Sephadex G25XK50/100色谱柱脱盐后备用，经以上步骤得到的F(ab′)₂抗体粗液纯度在61.5%，将以上F(ab′)₂抗体粗提液用1mol/L的Tris-HCl调节电导后到2～3ms/cm后上预先用pH8.0的0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose FF柱，用该缓冲液淋洗1-3倍柱床体积后，用0.1mol·L^-1Tris-HCl+0.5mol·L^-1NaCl缓冲液进行线性梯度，0%→100%，3倍柱床体积洗脱，收集穿透峰，将收集的活性峰产物经Sephadex G-25柱脱盐或8000-10000Kda超滤膜超滤脱盐后经0.22μm膜过滤除菌再冻干获得F(ab′)2冻干品。