[发明专利]一种瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种反刍动物瘤胃微生态研究检测用的瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌的构建方法。

背景技术

众所周知，反刍动物的消化中重要的消化过程之一是瘤胃微生物的消化（朱伟云，2004）。但由于瘤胃微生态研究的难度较大，目前还都局限于营养素在瘤胃中的消化率、瘤胃优势菌群的培养，或用药物控制瘤胃微生物等的研究（Koenig等，2000；韩春艳等，2002；Hristov等，2004）。对于瘤胃微生态中微生物之间的互作，如细菌与原虫、真菌的共生；原虫对细菌、真菌的吞噬等还都不得而知，其主要原因就是对于这一黑箱还没有更好的研究方法。为此，同位素标记方法也曾经用于瘤胃细菌标记（刘翔等，2010），但此方法涉及特殊设备并存在一定的环境问题，而不适宜于一般实验室的常规测定使用。我们实验室前期探索的荧光素（Fluorescein）染料标记瘤胃细菌，但研究的也是染色后是静态的死细菌（王梦芝等，2010），没有所标记细菌的繁殖生长，不能够完全反应瘤胃真实的动态状态。因此亟待解决的关键问题是瘤胃微生态亮化的研究方法。

在Aequorea victoria水母中发现的绿色荧光蛋白GFP只需蓝光激发就能发光。而且GFP其相容性强，没有种属、组织等特异性，通过基因重组水母外的生物也产生了GFP，如：荧光的菌、鼠、兔、猪等相继培育成功。由于GFP的特殊结构与性能，利用其做生物标记工具的研究逐渐增多（Chalfie等，1994；黄倩和李川源，2001；Southward和Surette，2002；DeBlasio等，2010）。

瘤胃细菌种类繁多，据研究表明有200余种，其中溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrivolen）具有较宽的底物代谢范围，在瘤胃中广泛存在，是理想的基因受体。目前已经构建成功木聚糖酶基因的溶纤维丁酸弧菌重组菌（Flint和Scott，2000）。若转入绿色荧光蛋白基因，构建绿色荧光蛋白基因工程溶纤丁弧菌，用之即可亮化瘤胃微生态环境，实时、客观记录瘤胃微生态微生物的动态观察，研究瘤胃微生态消化代谢规律和机制。

本发明即是基于瘤胃细菌GFP工程菌的改造，提供一种能够进行瘤胃微循环检测的瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白基因工程菌。

发明内容

为了突破目前不能真实模拟和反应瘤胃微生态的状态，而不能进行客观研究瘤胃微生态互作等的现状，本发明提供一种瘤胃微生态研究用的瘤胃溶纤丁酸弧菌绿色荧光蛋白基因工程菌（RGFPB）的构建方法。

本发明所述的瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌，宿主菌为瘤胃溶纤维丁酸弧菌，宿主菌中含有原核表达载体pET15b-EGFP；所述原核表达载体pET15b-EGFP是将增强型绿色荧光蛋白EGFP基因亚克隆连接入原核表达载体pET15b的BamH1位点而得到。

所述瘤胃绿色荧光蛋白GFP基因工程菌通构建方法是：采用增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，PCR扩增其编码序列；将所扩增序列亚克隆连接入原核表达载体pET15b，构建得到pET15b-EGFP；氯化钙法致敏瘤胃溶维纤酸丁弧菌，转化入所构建的原核表达载体pET15b-EGFP；转化后平板上培养24～36h，荧光或紫外光下观察，有绿色荧光的菌落则为阳性克隆。

本发明还公开了所述瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌在瘤胃微循环检测中的检测与应用。

所述的检测，例如瘤胃溶纤维丁酸弧菌绿色荧光蛋白GFP基因工程菌绿色荧光蛋白表达性能测试方法为：用液体和固体培养基培养瘤胃GFP基因工程菌24～36h。用722型分光光度计测定（600nm检测）并制作液体培养基中瘤胃GFP基因工程菌生长曲线、用SpectraMaxM5多功能读板机测定液体培养基中工程菌荧光强度（510nm检测）；用荧光显微镜检测固体培养基工程菌RGFPB表达情况。

本发明的原理是：