[发明专利]高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.如权利要求1所述的一种高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其特征在于：将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中任何一个或多个的丙氨酸Ala突变为丝氨酸Ser所形成的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体。

3.如权利要求2所述的一种高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其特征在于：所形成的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

4.如权利要求1所述的一种高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其特征在于：SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第55、68、77、105位4个丝氨酸的任何一个或多个被丙氨酸取代后所形成的谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体。

5.如权利要求4所述的一种高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其特征在于：所形成的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

6.一种高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示。

7.权利要求1所述的高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX2突变体的制备方法，其步骤如下：

1）、表达载体的构建：根据本发明所述GPX2突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白的基因，确保靶基因的5′端含有起始密码子ATG，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子中第55、68、77和105位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，第40位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子，并根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将基因中所有的ACA序列全部替换为非ACA序列所得到的编码基因；或其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白，且全长不含有ACA序列的编码基因；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX2突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX2突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1）中构建的含有GPX2突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得GPX2突变体蛋白纯品；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

所述的将液体低温离心，是在4℃，8000-12000g离心15-30min；

或，

1）、表达载体的构建：

根据基因文库中公开的GPX2的基因序列设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保基因的5′端含有起始密码子ATG，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX2中要突变为半胱氨酸的40位硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX2基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变成半胱氨酸的密码子；同理，用上述定点突变的方法在确保不引入ACA序列的前提下，将GPX2基因中的其它半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子，再根据密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，将GPX2基因中所有ACA序列突变掉；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在营养缺陷型菌株中表达本发明所述的GPX2突变体蛋白；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性转化子的筛选及突变体蛋白的表达与纯化

用步骤1）中构建的含有GPX2突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含半胱氨酸的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将表达核酸内切酶MazF的质粒pMazF转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有硒代半胱氨酸、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用半胱氨酸的密码子合成硒代半胱氨酸，直接表达出在底物谷胱甘肽的结合部位含有硒代半胱氨酸的重组GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得含GPX2突变体的上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

所述的将液体低温离心，是在4℃，8000-12000g离心15-30min；

或

1）、表达载体的构建：

根据本发明所述GPX2突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白的基因，确保靶基因的5′端含有起始密码子ATG，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的40位硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子；具体的基因序列是将GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，第40位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子所得到的编码基因；或是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPX2突变体蛋白的编码基因；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX2突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有而GPX2突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1）中构建的含有GPX2突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG诱导，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX2突变体蛋白，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得GPX2突变体蛋白纯品；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

所述的将液体低温离心，是在4℃，8000-12000g离心15-30min；

或

1）、表达载体的构建：

根据基因文库中公开的GPX2的基因序列设计引物，扩增其编码基因，在设计引物时，确保基因的5′端含有起始密码子ATG，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点；用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX2中要突变为半胱氨酸Cys的40位SeCys和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp；用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX2基因中的SeCys的编码序列突变成Cys的密码子；同理，用上述定点突变的方法将GPX2基因中的其它半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能在营养缺陷型菌株中表达本发明所述的GPX2突变体蛋白；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1）中构建的含有GPX2突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG诱导，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX2突变体蛋白，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得GPX2突变体蛋白纯品；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

所述的将液体低温离心，是在4℃，8000-12000g离心15-30min；

或

1）、表达载体的构建：

根据本发明所述的GPX2突变体的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成仪人工合成GPX2突变体的编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，3′端在终止密码子下游引入GPX2基因的3′端非翻译区的全部碱基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位点；具体的基因序列是将GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子所得到的编码基因，或是其它任何一种编码GPX2突变体蛋白的基因，但靶基因的3′端必须含有GPX2基因的3′端非翻译区的全部碱基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX2突变体基因和哺乳类细胞表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2突变体基因连同其3′端非翻译区或硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2羧基端343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，3′端含有终止密码子和特定的酶切位点，用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性细胞株的筛选：

用含有SBP2和GPX2突变体基因的载体在转染试剂的介导下共转染哺乳类细胞，用两个载体上的抗性基因通过抗生素浓度从高到低逐级递减法筛选兼具两种抗性的阳性细胞克隆，再用多孔培养板逐级放大培养阳性克隆，最终获得同时稳定表达SBP2和GPX2突变体两种外源蛋白的阳性细胞株；检测GPX2突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；

3）、靶蛋白的表达与纯化：

在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里，用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品；

所述的检测GPX2突变体蛋白的表达量，是以用抗GPX2的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

或

1）、表达载体的构建：

根据本发明所述的GPX2突变体的氨基酸序列在生物公司用DNA合成仪人工合成GPX2突变体的编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，3′端在终止密码子下游引入GPX2基因的3′端非翻译区的全部碱基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位点；具体的基因序列是将GPX2基因中第55、68、77和105位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子所得到的编码基因，或是其它任何一种编码GPX2突变体蛋白的基因或硒代半胱氨酸插入序列SECIS；用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX2突变体基因和哺乳类细胞表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2突变体基因连同其3′端非翻译区或硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2羧基端的343-854位的512个氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成仪人工合成其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，3′端含有终止密码子和特定的酶切位点，用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性细胞株的筛选：

先用含有SBP2基因的载体转染哺乳类细胞，通过该载体上的抗性基因筛选稳定表达SBP2的细胞株；再用含有GPX2突变体基因的载体转染稳定表达SBP2的细胞株，用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPX2突变体两种外源蛋白的细胞株；检测GPX2突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；

3）、靶蛋白的表达与纯化：

在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品；

所述的检测GPX2突变体蛋白的表达量，是用抗GPX2的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；

所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX2突变体，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

或

1）、表达载体的构建：

根据基因文库中GPX2基因序列设计引物扩增GPX2的编码基因及其3′端非翻译区的碱基序列，在设计引物时，确保靶基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，靶基因的3′端在终止密码子下游引入GPX2基因的3′端非翻译区的全部碱基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位点，确保第2位Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限性核酸内切酶切割两端有特定酶切位点的靶基因和哺乳类细胞表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2基因连同其3′端非翻译区组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX2中要突变为丝氨酸的半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在真核表达载体上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能编码本发明所述的GPX2突变体蛋白；根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2羧基端的343-854位的512个氨基酸的基因序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，3′端含有终止密码子和特定的酶切位点；同样经酶切连接后用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性细胞株的筛选：

用含有SBP2和GPX2突变体基因的载体在转染试剂的介导下共转染哺乳类细胞，用两个载体上的抗性基因通过抗生素浓度从高到低逐级递减法筛选兼具两种抗性的阳性细胞克隆，再用多孔培养板逐级放大培养阳性克隆，最终获得同时稳定表达SBP2和GPX2突变体两种外源蛋白的阳性细胞株；检测GPX2突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；

3）、靶蛋白的表达与纯化：

在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里，用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品；

所述的检测GPX2突变体蛋白的表达量，是用抗GPX2的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；

所述的用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白；

或

1）、表达载体的构建：

根据基因文库中GPX2基因序列设计引物扩增GPX2的编码基因及其3′端非翻译区的碱基序列，在设计引物时，确保靶基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，靶基因的3′端在终止密码子下游引入GPX2基因的3′端非翻译区的全部碱基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位点，确保第2位Cys的密码子替换成Ser的密码子，其它氨基酸序列不变；用相同的限性核酸内切酶切割两端有特定酶切位点的靶基因和哺乳类细胞表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX2基因连同其3′端非翻译区组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据GPX2中要突变为丝氨酸的半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长25-50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在真核表达载体上的GPX2基因中的全部半胱氨酸的编码序列突变成丝氨酸的密码子；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，确保突变后的基因能够编码本发明所述的GPX2突变体蛋白；根据基因文库中硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2羧基端的343-854位的512个氨基酸的基因序列设计引物扩增其编码基因，确保基因的5′端含有起始密码子ATG和特定的酶切位点，3′端含有终止密码子和特定的酶切位点；同样经酶切连接后用特定的酶切位点将SBP2基因组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上；所述的特定的酶切位点是表达载体的多克隆位点中含有的而靶基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性细胞株的筛选：

先用含有SBP2基因的载体转染哺乳类细胞，通过该载体上的抗性基因筛选稳定表达SBP2的细胞株；再用含有GPX2突变体基因的载体转染稳定表达SBP2的细胞株，用两个载体上的抗性基因筛选同时稳定表达SBP2和GPX2突变体两种外源蛋白的细胞株；检测GPX2突变体蛋白的表达量并筛选靶蛋白表达量高的细胞株；

3）、靶蛋白的表达与纯化：

在摇瓶中将同时表达两种外源蛋白的细胞株放大培养，在含有亚硒酸钠的培养基里用哺乳类细胞表达GPX2突变体，酶蛋白以可溶性形式分泌到培养基里；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX2突变体蛋白，透析冻干后即得酶蛋白纯品；

所述的检测GPX2突变体蛋白的表达量，是用抗GPX2的多克隆抗体和ELISA或GPX活力测定技术进行检测；

所述的用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX2突变体，是用pH7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脱杂蛋白，用含10mmol/L GSH的缓冲液洗脱目的蛋白。