[发明专利]一种P2X7-PANX1双表达载体、稳定系细胞、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种P2X₇-PANX1双表达载体，以及转染P2X₇-PANX1双表达载体的稳定系细胞，同时还涉及双表达载体、稳定系细胞的制备方法及稳定系细胞应用，属于生物技术领域。 

背景技术

三磷酸腺苷（ATP）是细胞能量供应和利用的物质形式，正常情况下胞外ATP（ATPe）含量很低。在中枢神经系统中，ATPe具有递质活性，往往称为胶质递质。与ATPe结合的嘌呤能受体分P2Y和P2X两类，前者属于G-蛋白偶联型受体，后者是离子通道型受体。P2X嘌呤受体有7个亚型，其中P2X₇受体（P2X₇R）最有特点，受体属阳离子通道，一价、二价的阳离子均可通过。ATP是其天然配体，生理浓度（微摩尔水平）ATPe激活P2X₇R可选择性地引起Ca²⁺、Na⁺内流，细胞去极化，神经细胞产生正常的兴奋活动。 

当神经系统受损后，死亡的细胞大量ATP释放到胞外，随后损伤周围区的ATPe浓度和P2X₇R表达上调，继而引起神经元继发性损伤。最新的观点表明ATP是一种死亡因子，而P2X₇R是凋亡和坏死的主要介导者。同时也指出ATPe短暂作用于P2X₇R，仅形成允许阳离子透过的通道；而高浓度ATPe，反复持久作用于P2X₇R，形成允许各种阳离子和900D以下的有机物质通过的膜孔，结果导致大量小于900Da的物质透出胞膜，而膜孔的形成基础是PANX1耦合在P2X₇形成的复合体上，PANX1被激活后细胞内稳态失衡而死亡，因此，PANX1-P2X₇膜孔形成和激活是细胞死亡的最终通路。 

凡是能影响P2X7受体激活以及PANX1通道膜孔形成的因素均可以有效干预细胞的凋亡和坏死，研究二者关系及激活模式是未来理论研究和药物开发应用的基础。 

发明内容

本发明的目的是提供一种P2X₇-PANX1双表达载体。 

其次，本发明还提供一种P2X₇-PANX1双表达载体的制备方法。 

同时，本发明提供一种转染P2X₇-PANX1双表达载体的稳定系细胞。 

最后，本发明提供一种转染P2X₇-PANX1双表达载体的稳定系细胞的应用。 

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是： 

一种P2X₇-PANX1双表达载体，含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序 列。 

具体的，P2X₇-PANX1双表达载体，含有如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列。 

一种P2X₇-PANX1双表达载体的制备方法，包括以下步骤： 

（1）利用PCR扩增P2X₇基因，将扩增产物连接到pEGFP-N1载体上，获得阳性重组质粒pP2X₇-EGFP，扩增P2X₇基因的引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示； 

（2）利用PCR扩增PANX1基因，将扩增产物连接到pDsRed-N1载体上，获得阳性重组质粒pPANX1-RFP，扩增PANX1基因的引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示； 

（3）利用PCR扩增pPANX1-RFP质粒上CMV:PANX1-dsRED-PloyA完整调控框架，利用PCR反向扩增pP2X₇-EGFP质粒骨架，两种扩增产物混合后直接转化宿主菌，挑取阳性克隆并提取质粒，鉴定即得P2X₇-PANX1双表达载体，用于pPANX1-RFP质粒的引物序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，用于P2X₇-GFP质粒的引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。 

一种转染P2X₇-PANX1双表达载体的稳定系细胞，制备方法包括如下步骤：