[发明专利]一种细胞杂交生产青蒿素的方法

权利要求书

1.一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1-1.5g、半纤维素酶0.5-1g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理25～40分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞；

步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1-1.5g、半纤维素酶0.5-1g、蔗糖3-7g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃条件下酶解0.5-1小时；通过离心得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体；

步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果；

步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养；

步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。

2.根据权利要求1所述的一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于所述的步骤四中筛选细胞的方法为：先经过液体培养，再生细胞壁后铺平板，荧光观察分辨融合的具青蒿素合成能力杂交细胞。