[发明专利]一种青藏高原藏羊mtDNA D-loop全序列及检测方法

权利要求书

1.一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，包括以下步骤：

(1) 绵羊mtDNA  D-loop 全序列的收集与分析：

收集绵羊mtDNA  D-loop全序列，并与近缘种的mtDNA  D-loop全序列进行比对，分析mtDNA  D-loop全序列在近缘种的mtDNA全基因组序列上的相对位置；

(2) 引物设计与PCR扩增：

根据mtDNA  D-loop基因在近缘种全基因组序列保守区域设计上、下游PCR引物，采用PCR方法扩增相邻的两个已知序列的未知序列；

(3) PCR产物测序与序列组装：

通过PCR产物测序反应体系对PCR产物进行测序、序列分析，将mtDNA  D-loop序列进行组装，获得mtDNA  D-loop全序列。

2.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述绵羊mtDNA  D-loop全序列的获得方法有三种:一种是从测序获得的基因组文库或转录组文库中查找;另一种是从GenBank数据库中公开的绵羊基因序列中查找；第三种是通过收集近缘种的mtDNA  D-loop 全序列进行同源比对，在保守区设计简并引物，然后以藏羊的DNA为模板进行PCR扩增，测序后获得青藏高原14个藏羊地方品种636个个体mtDNA  D-loop全序列。

3.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述近缘种为摩弗伦羊、羱羊、盘羊、亚洲A型、欧洲B型。

4.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(2)中，所述PCR引物和测序引物1对，其引物序列为：

Forward  primer：5’-GGCTGGGACCAAACCTAT-3’

Reverse  primer：5’-GAACAACCAACCTCCCTAAG-3’。

5.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(2)中，所述PCR方法中PCR扩增反应体系为30uL，包括基因组DNA模板2 uL、10×Buffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA聚合酶0.2 uL、3 pM上下游引物各3 uL、灭菌双蒸水16.8 uL；PCR反应程序为：94℃预变性5分钟、94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸90秒、36个循环、72℃延伸10分钟；最后12℃保存。

6.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(3)中，所述PCR产物测序反应体系为5 uL，包括基因组DNA模板（30-50 ng）3 uL、3 pM测序引物1 uL、Bigdye 0.5 uL、灭菌双蒸水0.5 uL；PCR测序反应程序为：95℃预变性2分钟、95℃变性10秒、51℃退火10秒、60℃延伸190秒、25个循环、12℃保存。

7.根据权利要求1所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(3)中，所述PCR产物的测序方法为双向、直接测序。

8.根据权利要求1或2所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，步骤(3)中，所述mtDNA  D-loop序列组装方法是：以摩弗伦羊的mtDNA  D-loop全序列为参照物，将所有14个藏羊地方品种636个个体的mtDNA  D-loop序列进行拼接，获得青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列。

9.根据权利要求8所述的一种青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列及检测方法，其特征是，所述青藏高原藏羊mtDNA  D-loop全序列长度的变化范围为977-1259bp。