[发明专利]青霉素G酰化酶突变体及其在合成头孢类抗生素中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物催化领域，尤其涉及一种青霉素G酰化酶突变体及其在合成头孢类抗生素中的应用。

背景技术

目前越来越多的药物或其中间体是通过一种生物酶催化合成的方式，而非化学合成。很明显，酶催化相比于传统的化学合成有极大的优势：（1）生物反应中可更好的避免有毒的反应试剂或溶剂；（2）酶具有高效率、底物特异性等特点；（3）更好的避免副反应的发生。

酰化酶是一类催化酰胺水解成相应羧酸的水解酶，其来源十分广泛且作用底物谱广，可以广泛作用于水解脂肪、芳香、杂环氨基酰胺类酰胺，但是酶活差别巨大。当底物为芳香、杂环类酰胺，尤其是存在邻位取代基时，酰化酶的活力受到显著干扰，这种干扰与空间位阻和电子效应有关。

立体选择性酰化酶是一种重要的手性合成工具酶，在制备手性羧酸及其衍生物方面具有广阔的应用前景，日益受到重视。近几年来腈化合物的生物催化技术迅速发展，酰化酶结合腈水合酶能有效地水解腈化合物生产多种酰胺和羧酸，应用于医药农药食品及饲料行业。研究发现，在腈水合酶/酰化酶的双酶体系中，立体选择性主要产生于酰胺水解这一步，尤其是对位为手性中心的底物，酰化酶具有很好的立体选择性，这使得它在制备手性中间体及光学纯的氨基酸方面具有巨大的潜力而日益受到工业界的重视。

青霉索G酰化酶属于水解酶家族，作用于肽键以外的碳-氮键，特别是直链酰胺键，其系统的名字是青霉素水解酶，其他共同的使用的名字包括青霉素酰化酶，脂肪酶，α-酰基-β-内酰胺水解酶，氨苄青霉素酰化酶。青霉索G酰化酶是β-内酰胺类抗生素工业中的一种具有重要意义的生物催化剂，不仅可以水解青霉素或头孢菌素，分别生成β-内酰胺类抗生素工业中的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）或7-ACA（7-氨基头孢烷酸），还能够半合成β-内酰胺类抗生素，Gardner等（KemPerman，G·&Hoogmeer，Complexes of beta-lactam antibiotics and l-naphthol，DSM,1999）首次报道了青霉素G酰化酶(PGA)合成头孢克洛，他们采用代号为AssemberlaseTM的活性酶在10℃下催化7-氨基-3-氯头孢烷酸（母核7-ACCA）和左旋苯甘氨酸甲甲酯（侧链）缩合反应从而获得了头孢克洛；并且采用了原位分离技术成功地分离出了头孢克洛。

国内外对于生物催化的研究越来越多，其中一个关键问题是所用的酶往往不能完全满足实际工业化生产的要求，酶的稳定性、活性、手性选择性等欠佳，如本申请中涉及的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的青霉素G酰化酶，虽然其能够催化缩合7-氨基-3-氯头孢烷酸（7-ACCA）与苯甘氨酸甲酯合成头孢克洛，但是酶活力较低，仅为1.2U/mg左右，因此，有必要对其进行改造，提高酶活力。在野生型酶的基础上设计点突变的构建新的突变体酶是一种常用的改善酶特性的方法。构建突变体酶的方法主要可分为三种类：非理性突变，半理性突变，理性突变。

非理性突变：首先对基因随机突变，获得基因文库后进行筛选出有利的突变体，其中，体外随机突变的技术多种多样，主要有易错PCR技术（error-prone PCR），DNA重排技术（DNA rearrangement method），基因家族重排技术（gene family rearrangement method）等。这种方法工作程序简单明了，可能会出现突变极好的突变体，但也可能不会。突变库容量较大，筛选出有利突变体的比例较低。

半理性突变：组合活性位点测试（CASTing）就是其中的一种。基本要点是：通过同源建模或晶体结构确定酶底物口袋中侧链朝向位点的氨基酸残基，同时选择可以与其相互作用的另一个残基，构建饱和突变体库，以达到减少突变库容量的同时增加筛选出有益突变的概率。其构库依据一般为选定底物口袋范围内的所有氨基酸残基，将侧链朝向底物口袋的选出，根据其所在的位点的二级结构（ɑ螺旋为n+4，β折叠为n+2，loop为n+1）选定另一个氨基酸，针对这两个氨基酸构建饱和突变进行筛选。这种策略构建的突变库库容量小，有效性高。

理性突变：在酶-底物三维建模和底物对接的基础上，加以软件分析，通过化学量子计算、热能计算、分子动力学分析等，在酶活性中心区域选择有效的点进行定向突变，直接获得有益的突变体。这种方法突变库的量极小，筛选出优突变的概率基本上达到100%。然而，前期的计算工作量极大，时间长需要知识的较多前期积累，现阶段还无法达到通过先计算再进行定点定向突变的程序。