[发明专利]基于单链抗体的金标试纸的制备方法

权利要求书

1.基于单链抗体的金标试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、通过中性氨基酸短肽连接的带正电标签单链抗体基因表达载体构建：

（1）在单链抗体基因的5′端通过基因重组引入编码带正电短肽标签,融合基因组成依次由编码带正电的短肽、中性短肽和单链抗体基因，或者在单链抗体基因的3′端通过基因重组引入编码带正电短肽标签,融合基因组成依次由编码单链抗体基因、中性短肽和带正电的短肽标签组成，带正电短肽标签组成：5-12个精氨酸残基或者5-12个赖氨酸残基或者6-12个二者混合氨基酸残基共同组成的短肽标签，分别以R5-12、K5-12、（RK）3-6表示，R精氨酸残基，K代表赖氨酸残基；中性短肽由8至20个天冬酰胺残基组成，N8-20, N代表天冬酰胺残基，在基因的另一端，通过基因重组引入编码6个组氨酸残基碱基序列；

（2）将以上融合基因构建到大肠杆菌质周腔表达载体上，融合的单链抗体将在大肠杆菌质周腔中表达；

二、将构建的单链抗体基因质周腔表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达3-6小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素；

三、收集菌体，提取质周腔可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化携带带正电标签的单链抗体；

四、制备金标单链抗体，将0.5毫升的300 纳克/毫升单链抗体逐滴加到8毫升的胶体金溶液中，轻轻混匀，混合液在室温反应1小时，然后，用10%的牛血清白蛋白（BSA）封闭30分钟，混合液在4摄氏度，以每分钟14000转离心30分钟，弃掉上清液，金颗粒沉淀用450微升1%的20 毫摩尔pH8.0的Tris缓冲的BSA重新悬起，加0.1的跌氮化钠，使用前金标的单链抗体储存在4摄氏度冰箱中；

五、免疫试纸条的制备，将1微升的待测抗原和抗6个组氨酸的单克隆抗体分别在室温固定在硝化纤维素膜上的检测区和质控区，将纯化的胶体金标记单链抗体作不同程度稀释后，均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫，在其他条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记单链抗体的稀释度，或称为工作浓度，取最适工作浓度的金标抗体以10微升/条加到金标垫上，然后真空冷冻干燥，密封保存。