[发明专利]用于检测SFRP2基因CpG岛甲基化的引物、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及用于SFRP2基因甲基化位点检测的方法、引物和试剂盒，采用焦磷酸测序技术，能对SFRP2基因甲基化频率进行检测，特异性好，准确度高，而且可以进行高通量筛查甲基化样本。 

背景技术

大肠癌是世界上第三位最常见的肿瘤，全世界每年有近100万新发病例，大约49.2万人死于大肠癌。但是在过去十年中，大肠癌的发病率和死亡率呈下降趋势，这可能归功于有效的筛选和监控。结肠上皮细胞从异常增生经腺瘤阶段发展到癌变平均需10年时间，这为早期筛查及预防提供了充分时间。在早期阶段大肠癌是最容易治疗的，但由于大肠癌早期多无症状，且有隐匿性，大约只有40%的患者在肿瘤局限期被检测出来，待出现症状大多已是中晚期。如能发现癌前病变（如腺瘤），通过及时的内镜下电凝切除可阻止癌变的发生，并且当大肠癌发现在早期临床阶段（如Ⅰ和Ⅱ期），肿瘤尚局限在肠壁中，外科手术治愈率分别为90%和75%，而进展型大肠癌预后较差，有远处转移的患者五年生存率只有5%。通过检测和清除可能发展成为大肠癌的病变可以降低大肠癌的发生率及提高初级预防，并且早期发现大肠癌将增加存活率。因此，对高危人群的早期筛查是防治大肠癌的关键。通过改变大规模人群的生活方式来减少大肠癌的发生率是难以实现的，而筛查可使大肠癌死亡率适度下降，并通过检测和去除大肠腺瘤（较少侵袭性的手术早期处理或内镜切除）而有可能降低大肠癌的发生率。现在大多数早期检测技术如大便潜血试验、气钡灌肠及电子纤维肠镜分别存在精确性低、费用高、侵袭性大、病人依从性不强甚至发生肠出血穿孔严重并发症等缺点，因而这些方法还不适合于筛查。因此，不仅需要在科学的基础上制定合理的筛查程序和宣传健康的饮食结构，更需要我们通过寻求简单、安全、高效、精确性高、非侵袭性的大肠癌筛查工具，从而有效地防治大肠癌，降低大肠癌的死亡率，这将具有重大的科学意义和实用价值。 

大肠癌和其他肿瘤一样，不仅是由渐进性遗传异常包括肿瘤抑制基因与癌基因以及染色体异常突变所驱动的一组疾病，也是由基因转录沉默所引起的表观遗传性疾病。表观遗传(epigenetics)是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以遗传给子代细胞的基因组修饰作用，DNA甲基化与组蛋白乙酰化修饰是表观遗传修饰的主要方式。癌基因和/或抑癌基因启动子区域CpG岛的DNA甲基化异常变化而沉默，随之基因表达丧失，成为近年来的研究热点。Wnt信号在动物发育中调节细胞生长、运动和分化并在成熟的器官中已日益 牵涉组织的内环境稳定。异常的Wnt信号通路在90%的大肠癌中是个早期事件，它促成肿瘤细胞的成长、增殖和凋亡。Wnt拮抗物分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRPs)具有抗Wnt/Frizzled信号的功能，SFRPs可能通过与Wnt蛋白相互作用阻止它们结合到FZ蛋白或者与FZ形成无功能的复合物来封闭Wnt信号。据报道，甚至在结肠癌细胞中当APC基因或FZ受体的下游β-catenin突变激活存在时，SFRPs能潜在地抑制整个经典型Wnt信号；SFRPs基因甲基化后的下调作用促成Wnt配体信号和细胞抵抗调亡，激活Wnt信号并持续整个大肠癌进展过程。因而SFRPs基因被称为是Wnt信号通路的“看门”基因，它们是起始结肠癌发生过程所必须的。人类有五种SFRP基因，其中SFRP2作为Wnt信号的调控基因，涉及肿瘤的发生和进展。SFRP2基因定位到染色体4q31.3，包含两个内含子和三个外显子，在SFRP2基因的第一个外显子周围有着高密度的CpG岛，这个CpG岛与肿瘤细胞DNA甲基化密切相关。据报道，在大肠癌的标本中，SFRP2基因的表达通过延伸于穿过这个基因外显子5'端CpG岛的超甲基化而受到抑制,SFRP2基因在正常结肠粘膜通常是非甲基化的并且能够表达，但在大肠癌中发生甲基化而沉默。大肠癌是有着高频的基因甲基化的肿瘤之一。基因的后生沉默在大肠癌发生的早期阶段中起着极为重要的作用。检测脱落到粪便中的存在于胃肠道肿瘤细胞代表特定的或遗传和/或表观遗传谱改变的分子标志物是一个种很有前景的非侵袭性大肠瘤变筛选方法。恶化前的腺瘤及大肠癌都可能用这种方式来检测，肿瘤抑制基因的CpG岛的超甲基化能导致肿瘤抑制基因的转录沉默，是大肠肿瘤发生的最常见的分子改变，许多基因的超甲基化与大肠癌的发生发展密切相关。由于甲基化改变往往发生在肿瘤变化的早期，易于在患者的粪便中检测到，并且DNA甲基化状态改变作为肿瘤标志物用于临床诊断，其特点和操作优于突变的检测。因此，粪便DNA甲基化检测已成为探讨早期筛查大肠癌新的研究热点，它与大肠癌的早期诊断、分期、治疗及预后密切相关，甚至可用于大批人群的筛选。在人类粪便DNA中检测超甲基化的SFRP2基因为检测和研究大肠癌可提供一种新的策略。