[发明专利]丝腺特异表达转录调控因子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种丝腺特异表达转录调控因子及其应用。

背景技术

丝腺是家蚕唯一能生产茧丝的器官，是整个蚕丝业的生物学基础，一头家蚕一般经过25d左右的生长发育，在幼虫期食下鲜桑叶约22g，合成并分泌0.5～lg的丝蛋白，特别是在5龄中、后期，家蚕能够以惊人的效率将桑叶蛋白转变成丝蛋白。它合成蛋白质的能力和效率，是迄今为止发现的所有生物组织器官中最强最高的一种。根据合成蛋白质的初步推测，这种高效率的蛋白质合成，不但需要众多基因的相互协调，而且基因的表达，大多数都具有高度的组织和时期特异性。家蚕只在其5龄中期后期，丝胶基因于中部丝腺大量表达合成丝胶蛋白，丝素基因（Fib-H,Fib-L，P25）在后部丝腺特异表达合成表达丝素蛋白。丝素蛋白主要由丝素重链蛋白（Fib-H）、丝素轻链蛋白（Fib-L）及P25蛋白以分子量6:6:1的比例组成。其中，Fib-H的含量高达70%以上，是丝蛋白的主要成分。家蚕茧丝合成量的多少及茧丝性能与Fib-H的表达量及蛋白结构密切相关，从野蚕驯化来的家蚕茧与现在的野蚕茧相比，其茧重比野蚕的要重10-20倍；而丝素重链基因的表达也相差上100倍以上。因此，提高丝素重链基因的表达有望提高茧的重量。研究发现，丝蛋白基因的特异表达是受丝腺组织一些特异的转录调控因子调控，同时一些泛在的转录调控因子也协作参与这一过程。根据丝腺中与蚕丝基因转录有关的转录因子的特性、将蚕丝基因表达调节中的转录因子分为两类，一种是组织特异因子，如SGF-1、SGF-2、SGF-B和PSGF。另一种是泛在的共同因子，包括SGF-3、SGF-4、TRIO、UB2a、UB2b及BMFA、FBF-A1。因此，如何获得丝腺特异表达转录调控因子的显得特别重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丝腺特异表达转录调控因子及其应用。

本发明提供的丝腺特异表达转录调控因子，其特征在于具有SEQIDNO.1的核苷酸序列或者与SEQIDNO.1具有99%以上同源性的核苷酸序列。

本发明另一方面还涉及丝腺特异表达转录调控因子表达蛋白，其特征在于含有SEQIDNO.2的氨基酸序列.

本发明另一方面涉及上述丝腺特异表达转录调控因子在增加丝素重链基因的表达中的应用。

本发明另一方面还涉及上述丝腺特异表达转录调控因子在作为提高家蚕茧丝量的合成的靶标基因中的应用。

附图说明

图1：pET-28a/Bmsage载体构建及原核表达纯化

图2：pGEX-4T-1/Bmsage载体构建及原核表达纯化

图3：Bmsage与SGF-1相互结合

图4：Bmsage与SGF-1复合物结合于Fib-H启动子的A和B位点并调控丝素重链基因的表达

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的内容不限于此。

实施例1

设计引物进行RT-PCR，引物序列为，

F:5’-CGCGGATCCATGTACAATCAAACATAC-3’，

R:5’-CCCAAGCTTAGTATCTCTGTTGACGC-3’，两端分别包括酶切位点BamHI和HindIII。以家蚕5龄3天丝腺cDNA为模板进行PCR，产物经纯化后克隆到pMD-19-Tsimple（Takara）载体上，得到pMD-Bmsage载体，序列测定表明，扩增的片段为编码这个基因的全长cDNA序列，其编码序列为SEQIDNO.1。

为了分离纯化Bmsage蛋白及制备多克隆抗体，构建Bmsage的重组蛋白表达载体。pMD-Bmsage质粒经BamHI/HindIII酶切克隆进pET28a载体中，得到pET-28a/Bmsage载体，转化大肠杆菌BL21，37℃下经0.2mMIPTG.诱导表达获得以包涵体形式存在的重组蛋白，经Ni柱分离纯化获得重组蛋白，重组蛋白用于抗体制备（图1）。为了获得可溶的Bmsage蛋白，构建带GST标签的pGEX-4T-1/Bmsage载体，酶切位点为BamHI/NotI，16℃下经0.2mMIPTG.诱导表达，获得可溶的Bmsage蛋白。经GST柱亲和纯化，获得较纯的可溶的Bmsage融合蛋白（分子量约55KDa），用于后期蛋白相互作用和蛋白与DNA探针的结合实验（图2）。