[发明专利]一种纯化凝血因子VIII的方法

权利要求书

1.一种纯化凝血因子VIII的方法，其特征在于，包括使含凝血因子VIII的液体通过以下纯化步骤处理：

i)阳离子交换层析；

ii)羟基磷灰石层析；

iii)免疫亲和层析；

iv)阴离子交换层析。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，凝血因子VIII为重组人凝血因子VIII。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，纯化方法的部分或全部步骤中包括抗氧化剂或游离氨基酸或具有抗氧化和净化作用的二肽。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于，抗氧化剂选自L-蛋氨酸、双偏亚硫酸氢钾或钠或重亚硫酸钠、t-丁基-4-甲氧基-酚、2，6-二(1，1-二甲基乙基)-4-甲基酚。游离氨基酸和有抗氧化和净化作用的二肽选自组氨酸、氨基乙磺酸、甘氨酸、丙氨酸、肌肽、鹅肌肽、1-甲基组氨酸或其组合物。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于，抗氧化剂优选是L-蛋氨酸。所用的L-蛋氨酸浓度范围为10-100mM。

6.如权利要求1至5所述的方法，其特征在于，步骤i)所述阳离子交换层析洗脱液包括至少一种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐；至少一种非离子型表面活性剂；以及至少一种将pH调节为6至8的缓冲物质，特别是将pH值调节至约中性值的缓冲物质。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自氯化钾或氯化钠；所述非离子型表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、卢兰尼克F68；所述缓冲物质选自缓冲能力在pH值为6至8之间的柠檬酸钠、组氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2-吗啉代乙磺酸或乙酸钠。

8.权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述步骤ii)羟基磷灰石层析的平衡液包含至少一种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐；至少一种非离子型表面活性剂；以及至少一种将pH调节为6至8的缓冲物质，特别是将pH值调节至约中性值的缓冲物质。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于所述无机盐选自氯化钾或氯化钠；所述非离子表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、卢兰尼克F68；所述缓冲物质选自缓冲能力在pH值为6至8之间的柠檬酸钠、组氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2-吗啉代乙磺酸或乙酸钠。

10.权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述羟基磷灰石层析包括至少一个洗涤、一个洗脱步骤。所述洗涤、洗脱步骤使用磷酸盐的缓冲体系，并包含至少一种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐；至少一种非离子型表面活性剂。

11.根据权利要求10权利要求所述的方法，其特征所述无机盐选自氯化钾或氯化钠；所述非离子型表面剂选自吐温-20、吐温-80、卢兰尼克F68；所述缓冲液物质为磷酸氢二钠。

12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，免疫亲和层析中包括至少两个平衡步骤，即上样前后的平衡液其它组分一样，差别主要是第一种缓冲液中不含有Ca2+离子源，而第二种平衡缓冲液中含有Ca2+离子源。先用第一种平衡缓冲液平衡，上样，但上样结束后，先用第一种平衡缓冲液进行平衡至基线后需要用第二种平衡缓冲液进行平衡。上样前后的平衡液中包含至少一种调节缓冲液离子强度的化合物，如无机盐；至少一种非离子型表面活性剂；至少一种将pH调节为6至8的缓冲物质，特别是将pH值调节至约中性值的缓冲物质。

13.权利要求12权利要求所述的方法，其特征所述无机盐选自氯化钾或氯化钠；所述非离子型表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、卢兰尼克F68；所述缓冲液物质选自柠檬酸钠、组氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2-吗啉代乙磺酸或乙酸钠。所述Ca2+离子源是氯化钙。