[发明专利]一种月桂酸修饰超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白酶化学修饰技术领域，尤其涉及一种月桂酸修饰超氧化物歧化酶的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)，是一种广泛存在于自然界动植物以及一些微生物体内的金属酶，是生物抗氧化酶类的重要成员，它能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基(O₂^-)，是生物体有效清除活性氧的重要酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线。它以超氧阴离子作为底物并催化其发生歧化反应，从而清除对机体有害的超氧自由基。其催化机理如下：

SOD（氧化型）+O₂^-——SOD^-（还原型）+O₂

SOD^-（还原型）+O₂^-——SOD（氧化型）+H₂O₂

总反应：2O₂^-+2H⁺SOD酶O₂+H₂O₂

当机体产生多余的超氧自由基且不能被及时清除时，就会引起机体疲劳，加速衰老同时诱发各种疾病。自由基学说认为：自由基具有高度的化学活性，是人体正常代谢的中间产物，可损害生物膜，是多种疾病产生、发展的根源。SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。由于超氧化物歧化酶的抗氧化作用，它已经被广泛的应用于医疗、化妆品及其它化工领域。

由于SOD受到半衰期短、相对分子质量大、不易透过细胞膜、口服时易受胃蛋白酶分解、体内特异性等因素的限制，很难广泛应用，因此必须对蛋白进行化学修饰。一般利用水溶性大分子如聚乙二醇、蔗糖、右旋糖肝和聚烯属烃基氧化物等对SOD进行共价修饰。但是由于上述物质的分子量较大，修饰后的蛋白具有很强的免疫原性，虽然酶学稳定性得到了很大的提高，但是仍然很难被人体所利用。而月桂酸修饰的超氧化物歧化酶(LA-SOD)则克服上述的问题，月桂酸与SOD分子表面的氨基作用，月桂酸表面疏水基团的引入，增加了酶表面的疏水性，遮盖了酶对热、酸、碱、有机溶剂及蛋白水解酶敏感的易伸展位点，因而大大地加强了酶的稳定性。同时，小分子的月桂酸疏水基团的引入还能掩盖酶分子的抗原决定簇，去除其免疫原性，更重要的是疏水基团对细胞膜和脂双层具有高度的亲和性，使大分子酶的透皮吸收有了理论基础。

但是现有的月桂酸修饰超氧化物歧化酶的技术却大都存在着回收率低、有害物质残留和稳定性差等一系列问题，严重限制了月桂酸修饰超氧化物歧化酶的工业应用。

发明内容

本发明的目的就是解决现有技术中月桂酸修饰超氧化物歧化酶的技术回收率低、有害物质残留和稳定性差等问题，提供一种月桂酸修饰超氧化物歧化酶的方法。

为实现该技术效果，本发明提供了如下的技术方案：

一种月桂酸修饰超氧化物歧化酶的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将100～200ml月桂酸、5～15g氯化亚砜和5～10ml的催化剂吡啶DMF加入到反应器中，加热至90～95℃，搅拌反应1～3小时，再回流1～3小时，

（2）回流结束，让反应物进行分馏，减压，除去过量的氯化亚砜，收集146～150℃的馏分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、冻干为白色粉末，置于冰箱中保存，

（3）取150～250g浓度为4500U/mg的牛血Cu/Zn-SOD溶于15-20L弱碱性缓冲液中，在20℃下搅拌溶解，边搅拌边加入40～60ml活化的月桂酸，然后升温至40℃，搅拌60min后，将溶液浓缩至2000～3000ml，然后迅速降温至室温，

（4）加入3倍体积量的-18℃的无水乙醇，用转速为4000r/min进行离心，收集沉淀，将沉淀溶解于1500～2500ml的双蒸馏水，再用4500r/min的转速进行离心，除去不溶物，取上清液通过中空纤维透析器，兑蒸馏水透析，透析液预先用缓冲液平衡好的层析柱层析1.5-2.5小时，最后收集酶活性部分、透析、超滤、冻干，得到月桂酸修饰的超氧化物歧化酶(LA-SOD)。