[发明专利]热启动DNA聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热启动DNA聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用。

背景技术

PCR技术在应用时存在着非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成或凝胶电泳上无扩增带的问题。

目前以上技术问题通常通过热启动PCR技术来解决，在热启动PCR技术中通过特定的热启动DNA聚合酶来帮助实现热启动PCR的过程，但是在常规的热启动PCR反应过程中需要对反应体系中的组分进行封闭来保证热启动PCR反应过程的顺利进行。常用的热启动PCR封闭方法有化学封闭法、物理隔绝法、DNA结合蛋白抑制法等。但是化学封闭法需要预加热，容易造成DNA损伤；物理隔绝法操作步骤复杂，容易对扩增产物造成污染；DNA结合蛋白抑制法是采用单链DNA结合蛋白与DNA链结合保持其单链特性，防止两条互补单链再次结合为双螺旋以及形成链内二级结构、防止被核酸酶水解，但是单链结合蛋白在反应体系中经过多次的高低温循环容易使肽键断裂丧失其应有的功能。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种热启动DNA聚合酶的制备方法、制备的聚合酶及其应用，可以解决热启动PCR技术中容易DNA损伤、产物污染、封闭不完全导致热启动效果不好的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：获得单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶；

将所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶组分按照比例混合；

所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的含量分别都为20～40%。

在上述技术方案中，所述单链DNA结合蛋白、所述Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及所述Taq DNA聚合酶的比例为1：1：1。

根据上述技术方案的方法制备的热启动DNA聚合酶。

上述热启动DNA聚合酶在热启动PCR中的使用方法，所述热启动DNA聚合酶一次性加入PCR反应体系所需组分中。

本发明通过将单链DNA结合蛋白、Taq DNA聚合酶单克隆抗体以及Taq DNA聚合酶提前混合制备热启动DNA聚合酶，在使用时可以一次性加入，避免分别加入时的多次操作对PCR反应体系造成污染；单链DNA结合蛋白和引物结合，使得结合了DNA结合蛋白的引物无法与模板及DNA聚合酶结合，可避免产生非特异性扩增，单链DNA结合蛋白虽然在反应体系中经过多次的高低温循环容易使肽键断裂丧失功能，但通过Taq DNA聚合酶单克隆抗体的加入抑制了Taq DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，弥补了单链DNA结合蛋白使用中的不足；本发明还选择了热启动DNA聚合酶中各组分合适的比例，提高了PCR反应的扩增特异性。

附图说明

图1为本发明实施例一、二、三及对比实施例一制备的热启动DNA聚合酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为实施例二PCR样本跑胶结果；5、6两条带为实施例三PCR样本跑胶结果；7、8两条带为对比实施例一PCR样本跑胶结果。

图2为本发明实施例1制备的热启动DNA聚合酶与商业用酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为TAKARA LA taq PCR样本跑胶结果；5、6两条带为TransTaq^TM HiFi DNA Polymerase PCR样本跑胶结果；7、8两条带为Phire Hot Start DNA Polymerase PCR样本跑胶结果。

图3为本发明实施例2制备的热启动DNA聚合酶与商业用酶PCR实验效果比对图。其中1、2两条带为实施例一PCR样本跑胶结果；3、4两条带为TAKARA LA taq PCR样本跑胶结果；5、6两条带为TransTaq^TM HiFi DNA Polymerase PCR样本跑胶结果；7、8两条带为Phire Hot Start DNA Polymerase PCR样本跑胶结果。