[发明专利]周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）周期型马来丝虫pcDNA3.1（+）-BmCPI/BmGAPDH重组质粒的抽提：

(1)将含有重组质粒的菌种室温融化后取50ul加入到含有50ul、100mg/ml氨苄西林钠的100ml LB溶液中置于37℃恒温、250rpm的摇床培养12-16h，之后放置4℃冰箱冷却；

(2)菌液培养12-16h后，使用紫外分光光度计测定其OD600值，OD600数值在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，则可以用来进行质粒的抽提；

(3)取上述培养后的菌至50ml离心管内，5000rpm离心1分钟，收集沉淀，弃上清；

(4)每管加入5ml溶液I,重悬细胞沉淀；

(5)之后每管加入5ml溶液II，颠倒离心管4-6次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明；

(6)每管加入5ml溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生，然后5000rpm室温离心10-20分钟；

(7)将上清倒入或吸入到质粒纯化柱内，5000rpm室温离心2分钟，倒弃收集管内液体；

(8)在质粒纯化柱内加入7ml溶液IV，5000rpm室温离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体，之后再5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；

(9)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml溶液V至管内柱面上，放置2分钟，然后5000rpm室温离心2分钟，所得液体中加入10ml溶液VI混匀后加到原质粒纯化柱内；

(10)再次室温离心2分钟后，倒弃收集管内液体；

(11)在质粒纯化柱内加入15ml溶液IV，5000rpm室温离心2分钟，近一步洗去杂质后，倒弃收集管内液体；

(12)5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；

(13)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml溶液V至管内柱面上，放置2分钟；

(14)5000rpm室温离心2分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒；

(15)取DNA水溶液，用双蒸水稀释400倍，以双蒸水作空白对照，在紫外分光光度计上读取样品的测定浓度及A260/A280的值，并将其贮存于-20℃用于基因转染；

所述溶液I为质粒大量抽提试剂盒的悬浮液；溶液II为质粒大量抽提试剂盒的裂解液；溶液III为质粒大量抽提试剂盒的结合液；溶液IV为质粒大量抽提试剂盒的洗涤液；溶液V为质粒大量抽提试剂盒的洗脱液；溶液VI为质粒大量抽提试剂盒的DNA纯化结合液；

（二）Hela细胞的复苏、培养和传代

(1)从-80℃冰箱中取出冻存Hela细胞的EP管，并直接投入37℃恒温水浴锅中，不时摇动使其融化；

(2)当完全融化时，从37℃温水中取出EP管，1200转/分，离心3分钟；

(3)弃上清，用含有10％体积小牛血清和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM完全培养基重悬细胞沉淀，接种到培养瓶中，放在37℃、5%CO2细胞培养箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养；

(4)当Hela细胞长满培养瓶底的70%～80%满时，传代，倒掉培养瓶中的培养液，用2ml PBS缓冲液洗涤两次；

(5)加入0.25%W/V胰酶lmL消化lmin，待瓶底细胞开始脱落时倒掉胰酶，加入8mL含有10%胎牛血清和双抗的DMEM完全培养基，用移液枪吹打瓶底细胞使其脱落并混匀，吸取4mL至另一培养瓶继续培养；

（三）基因转染

(1)提前24小时在96孔板中接种细胞55孔，每种浓度设5个复孔，接种量为使第二天长成25%单层，置CO2孵箱中37℃培养过夜；

(2)将培养液换成含抗生素G418的培养基，抗生素浓度按梯度递增：0μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml和1000μg/ml；

(3)培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准，最后获得最佳筛选浓度为400μg/ml，筛选稳定表达克隆时比该浓度提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半；

(4)转染前一天，将细胞用0.25%W/V胰酶消化、计数并铺板，使其在转染当天细胞融合度为80—90%，细胞铺板在2mL含胎牛血清和双抗的DMEM培养基中；在六孔板中按以下方式进行转染，a、b作为对照：

a．DNA转染空白对照

b．pcDNA3.1(+)

c．pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH；

(5)对于每孔细胞，使用250ul不含胎牛血清和双抗的DMEM培养基稀释4ug～5ug DNA，多孔操作时批量制备；

(6)对于每孔细胞，使用250ul不含胎牛血清和双抗的DMEM培养基稀释10ul Lipofect脂质体转染试剂，Lipofect稀释后，在5min内同稀释的DNA混合，保温时间过长会降低活性，可以批量制备；

(7)混合稀释的DNA和稀释的Lipofect脂质体转染试剂，在室温保温15min；

(8)使用2ml/孔的转染培养基在转染开始前洗涤细胞，转染培养基更换为不含血清的DMEM培养基；

(9)将稀释的复合物加入到细胞当中，摇动培养板，轻轻混匀在37℃、5%的CO2中保温24-48h；

（四）阳性克隆的筛选

(1)转染24小时后按1:10的比例将转染细胞在6孔板中传代，再培养24h后六孔板中的培养基更换为预试验中确定的400μg/ml浓度的G418选择培养基，然后按照下面不同生长情况的细胞用筛选培养基对阳性细胞进行筛选：

a．DNA转染空白对照

b．pcDNA3.1(+)

c．pcDNA3.1(+)-BmCPI/GAPDH

加入按配制好的G418筛选培养基，筛选时比预实验提高一个等级浓度；

(2)根据培养基的颜色和细胞生长情况，每2～3天更换一次筛选培养基；当观察到a、b、c中大部分细胞大部分死亡或a中细胞全部死亡时，把培养基G418浓度减半维持筛选作为维持培养基，待其逐渐增大，此时血清浓度可加大为15%；

(3)当在显微镜下见到有阳性克隆形成时，准备挑取克隆；

（五）阳性克隆的提取和扩大培养

(1)观察细胞克隆，用标记笔在培养板底面对要分离的阳性克隆做标记；

(2)撤去培养基，用PBS轻轻冲洗细胞克隆；

(3)用无菌镊夹取一个克隆培养环，蘸取灭过菌的凡士林，凡士林面冲下，压放在培养板中生长旺盛的阳性单克隆上，使凡士林均匀分布在克隆培养环底面，克隆环圈在所需克隆团上；

(4)在六孔板同一个孔上重复步骤(3)，用圈套2到3个其它所需克隆团；

(5)加0.25%胰酶充满环内，20秒后弃去胰酶；

(6)盖上六孔板，37℃，15分钟；

(7)每个环中加0.1ml至0.2ml的培养基；

(8)依次对每个克隆用吸管吹打以分散细胞，并将细胞悬液分别移入24孔板的孔中，每个细胞克隆都应配备各自的吸管或枪头；

(9)再用0.1ml至0.2ml的培养基冲洗克隆环，再将这些培养基分别移入相应的24孔板中；

(10)将培养孔中的培养基加至0.5ml，盖好，继续培养；

(11)当克隆细胞长满24孔板时，即可消化传代至六孔板中，加2ml培养基继续扩大培养；

(12)六孔板中细胞长满后即传代至培养瓶继续培养，直至冻存；

（六）阳性克隆的冻存

阳性克隆细胞（pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH）在筛选培养基中生长状态稳定后开始对它们进行冻存：

(1)选取对数生长期的细胞，在冻存前一天更换一次培养基；

(2)倒掉培养基，PBS轻轻冲洗细胞克隆后，用0.25%W/V的胰酶消化细胞，把消化好的细胞收集于离心管中离心，倒掉培养基和胰酶；

(3)加入冻存液，冻存液中的细胞的最终浓度为5×10⁶，用移液枪吹打，然后分装入细胞冻存管中封好，放入-80℃冰箱中冻存；所述冻存液包括10％体积分数的DMSO冻存培养基和10%体积分数的胎牛血清；

（七）检测阳性克隆，抽提细胞总RNA，分子水平检测重组质粒在细胞中的表达：

(1)六孔板中细胞弃上清，PBS清洗后每孔加入1ml Trizol试剂，用移液枪吹打溶解细胞后移入新的1.5ml Ep管中；

(2)15-30℃温育5min，确保核蛋白复合物的彻底分离；

(3)加入0.1ml氯仿，充分振荡15s，15-30℃温育3min，2-8℃12000rpm离心15min；

(4)将上层液体转移至另一Ep管内，加入0.3ml异丙醇，15-30℃温育10min；2-8℃12000rpm离心10min；

(5)弃上清，用0.5ml75%DEPC-乙醇冲洗沉淀一次，2-8℃12000rpm离心15min。

(6)干燥5-10min，加入20μl DEPC-DDW，55-60℃温育10min，即为提取的RNA，保存于-80℃备用；

(7)逆转录合成cDNA第一链在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：

（1-5ug）总RNA；

2ul oligo（dT）15；

2ul dNTP（2.5mM each）；

补RNase-free ddH2O定容至14.5ul；

(8)70℃加热5min后在冰上冷却2min；简短离心收集反应液后加入以下各组分：

4ul5×First-Strand buffer(含有DTT)；0.5ul RNasin。

(9)加1ul、200U的TIANScript M_MLV，轻轻用移液器混匀。

(10)42℃温温50min；

(11)95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20度冷冻保存。

(12)PCR扩增基因；计算引物Tm值，P1 Tm=62.02,P2 Tm=64.94，在0.5m1 Eppendorf管中按下表建立25μl的PCR反应体系：

PCR反应体系

反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45秒；

57℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃再延伸7min，4℃冷却终止反应；扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；

（八）蛋白水平检测重组质粒在细胞中的表达

收集细胞中的蛋白，裂解蛋白的所有步骤都在冰上进行：

（1）从-20℃将RIPA裂解液取出融解，混匀；取裂解液，在使用前数分钟加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；

（2）去除培养液，用无血清培养液洗一遍，按照6孔板每孔加入200μl～250μl的比例加入裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；

（3）裂解后，15000rpm离心15min，取上清，置1.5ml灭菌离心管中；

（4）新收集细胞蛋白的EP管中加入等量loading buffer，100℃煮沸5-10min，-20℃保存备用；

（九）表达产物进行SDS-PAGE分析

（1）配胶：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。按下表依次加入各试剂并混匀，制胶。各样品加入体积如下表：

分离胶组份配制（12%）

浓缩胶组份配制(5%)

将电泳玻璃板固定在夹子上，灌制分离胶于玻璃板夹层中，立即用异丙醇封顶压胶，水平静置，室温聚合1h；倒去分离胶上层异丙醇，用滤纸吸掉多余液体，均匀加入浓缩胶，立即插入梳子，室温聚合45min；

（2）上样：浓缩胶凝聚后拔出梳子，将含有胶的双层玻璃板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，将蛋白质分子量标准参照物和样品依次上样；

（3）电泳：样品侧接负极，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V；需电泳4～6h，直到溴酚蓝达分离胶底部；

（4）考马斯亮蓝染色：剥下凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中，于摇床上摇动，振荡染色约1～2h；

（5）将凝胶转移到盛有脱色液的平皿中，于摇床上摇动，每15min换一次液，重复2～3次后，至背景无色，拍照观察结果；

（十）周期性马来丝虫重组蛋白的提取和纯化

①阳性克隆细胞的无血清培养

(1)对所有的阳性克隆细胞先用筛选培养基和维持培养基培养；

(2)当细胞单层长满瓶底后，按1:2至1:4的比例进行传代，之后换成5%血清浓度混合培养基；

(3)两天至三天后，重复操作(2)，并依次逐步降低培养基中血清浓度，三到四次之后全换用无血清培养基；

(4)使用无血清培养基培养的细胞此时会开始悬浮生长并产生大大小小的细胞团；

(5)细胞团的产生对悬浮培养产生困扰，通过预实验获得5U/ml肝素钠可以解决细胞结团的问题，因此，下次换液时改用含肝素钠培养基并将细胞吹打均匀，使细胞完全悬浮生长；

(6)培养后，保留细胞培养上清，待下一步对细胞和细胞培养上清中的目的蛋白进行纯化；

②粗提蛋白

(1)从-20℃将RIPA裂解液取出融解，混匀；取裂解液，在使用前数分钟加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM；

(2)去除培养液，用无血清培养液洗一遍，按照每个细胞培养瓶中加入400μl～500μl的比例加入裂解液，用枪吹打数下；

(3)加入RIPA细胞裂解液重悬沉淀后，置于冰上，以40%最大输出功率，1次/10s超声裂解细胞；

(4)冰上静置30min后，4℃，12000rmp离心30min，收集上清液；用BCA比色法测定上清液中的蛋白质浓度；

③无血清细胞培养上清中目的蛋白的纯化

(1)用0.45um的过滤器过滤无血清培养基的上清20ml；

(2)将过滤到的细胞培养上清和无血清培养基与木瓜蛋白酶0.5ml在4℃下搅拌24小时；

(3)填充柱的准备：5ml保留金属针头的注射器，并在底部塞上尼龙毛；

(4)平衡柱子：用5-10倍柱子体积的冲洗缓冲液洗涤柱子，估算尼龙毛所吸附的缓冲液的体积做为柱子体积；

(5)把(2)中的混合液上柱，过柱；

(6)用5-10倍柱体积的冲洗缓冲液过柱；

(7)用洗脱缓冲液以每小时50倍柱体积的流速洗脱产物；

(8)将洗脱下的样品收集到中和缓冲液中分装后置于-20℃中。