[发明专利]结核分枝杆菌链霉素耐药相关的新突变位点及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌耐药碱基突变位点的高通量筛选和验证，具体涉及一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变位点的筛查和验证。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。到20 世纪80 年代后期，由于贫困、艾滋病、人口流动和耐药等因素，结核病发病率和死亡率在全球范围内出现快速回升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。结核分枝杆菌耐药情况严重，耐药率高达46％，给结核病的预防和治疗构成严峻挑战。

抗结核药物是结核病化学治疗的基础，而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。链霉素发现于20 世纪40 年代，是最早出现的有效抗结核的氨基苷类抗生素药物，也是治疗结核病的一线药物之一。链霉素是一种氨基环醇糖苷类抗生素，主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，与结核分枝杆菌的核糖体30S 亚单位结合，诱导遗传密码的错配，破坏翻译过程的正常进行，合成结构功能异常的蛋白从而发挥其杀菌作用。链霉素经常单独给药，因此其耐药性发展较快。结核分枝杆菌耐链霉素的主要分子机制是编码小亚基的S12 蛋白的rpsL 基因和编码16S 核糖体RNA 的rrs基因突变，从而抑制药物结合核糖体的能力，造成对链霉素耐药。目前所知的结核分枝杆菌的耐链霉素药的原因，主要是由基因rpsL第43位碱基发生A→G的突变。结核分枝杆菌链霉素耐药性的检测对于正确选择有效的抗结核化疗方案，有效控制耐药性结核分枝杆菌的传播以及控制结核病有极其重要的意义。

目前临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因型检测两类，并以前者为主。然而表型检测因为各种原因，如耗时、设备昂贵、有放射性危害或干扰因素多等，难以形成快速高效的筛查手段。相对而言，基因检测更为直接，目前已经使用的基因分析方法有单链构象多态性分析法(SSCP)，限制性片段长度多态性分析法(RFLP)，DNA 测序法，线性探针杂交法，RNA/RNA 错配分析法，以及DNA 阵列( 芯片) 检测等。这些方法主要利用基因rpsL第43位碱基的A→G突变的标准，检测样品结核分枝杆菌是否发生同样的突变，从而快速判断结核分枝杆菌是否具有链霉素耐药性，但仍有许多耐链霉素的结核分枝杆菌不能被检测出来，呈假阴性。

结核病耐药率高是造成结核病疫情难以控制的重要原因，而传统的结核分枝杆菌药敏试验费时长，影响患者诊治，增加耐药株扩散机会，那么有效提高分子生物学方法快速鉴定结核分枝杆菌耐药性的检出率和准确率具有重要意义。较高的结核分枝杆菌链霉素耐药性的检出率，对临床耐药性检测和用药具有指导意义。

发明内容

本发明的目的在于提供结核分枝杆菌链霉素耐药新突变位点。

本发明的另一目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜。

本发明的再一目的在于提供一种结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速筛查法。

本发明所采取的技术方案是：

一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变位点，该突变位点位于标准株H37Rv基因组的第1338631位，即基因间区Rv1194c-Rv1195的第47位，发生的点突变为碱基C替换为A。

一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测试剂盒，该试剂盒含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。

一种检测结核分枝杆菌耐药突变碱基的检测膜，该膜含有用于检测链霉素耐药突变基因间区Rv1194c-Rv1195的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO : 1或其碱基互补序列。

一种结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速筛查法，该方法利用PCR扩增法检测基因间区Rv1194c-Rv1195第多少位的碱基。

本发明的有益效果是：

本发明发现的链霉素耐药突变位点提高了结核分枝杆菌耐链霉素的分子检测水平，阳性检出率在原有的基础上增加了22.22%，能够有效缩短患者的诊断时间，节约患者治疗时间和费用。

本发明发现结核菌耐药突变位点不仅发生在编码区，同时也可能发生在非编码区，提示基因间区（IGR）的碱基突变可能也与耐药相关，即IGR区也存在耐药生物标志物。该发明为找到新的、更有效的结核病耐药分子标识物提供了一种新的思路。

附图说明