[发明专利]一种生物杀菌剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种生物杀菌剂及其制备方法，尤其是涉及一种生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)及其制备方法。 

背景技术

生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)主要来源于绿针假单胞菌株的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，被认为是一种天然的、具有高效抑制植物病原菌的抗菌物质。具有强烈的抗真菌特性，也抑制部分细菌的活性。但是目前还没有N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼作为生物杀菌剂及其制备方法方面的报道。 

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生物杀菌剂及其制备方法。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36培养制得，所述的菌株SN36在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7846；保藏时间：2013-7-03，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis。 

一种生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；在接种种子液前，加入黏稠剂，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加IturinA及其同系物产量的目的。接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液C的补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。 

所述的培养基和补料液具体组分按g/m1计为： 

液体培养基A：葡萄糖0.8％-6.0％，蛋白胨0.4％-6.0％，牛肉膏0.2％-3.0％，硫酸镁0.06％-1.0％，磷酸二氢钾0.2％-1.0％； 

液体培养基B：玉米淀粉2.0％-10.0％，黄豆粉3.0％-12.0％，黄豆芽汁5.0％-15.0％，硫酸镁0.1％-1.2％，磷酸二氢钾0.4％-1.5％； 

补料液C：1.0％-6.0％葡萄糖稀释液。 

所述的黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液。 

所述的黏稠剂的浓度范围为0.5-20.0g/L发酵液。 

所述的黏稠剂的流加补料液C的方式为连续流加方式或间歇式流加方式。 

所述的黏稠剂的连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.01-5.0L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前8小时。 

所述的黏稠剂的间歇式流加的间歇时间为每隔3-24小时补料1-6次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％。 

所述的黏稠剂的间歇式流加每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。 

所述的二级发酵培养的温度为26℃-37℃，pH为6-8，时间为3-6天。 

发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。 

采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。 

采用本发明工艺，在第二级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比；通过采用一定比例的黏稠剂，提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1- 甲酰肼)的产量。