[发明专利]一种分离培养海马神经细胞的方法及其专用培养液

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种海马神经细胞分离与原代培养方法及试剂。

背景技术

海马(hippocampal)是中枢神经系统的重要组成部分，作为神经元高度集中的区域，具有中枢神经系统的典型特性，在学习、记忆、情绪反应及自主神经功能等方面发挥重要作用。神经元细胞培养模型是研究神经元发育分化、神经再生、神经疾病的发生机制等重要的实验模型，体外培养海马神经元已成为研究阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的重要技术手段。原代培养(primary culture)是指从活体细胞获得细胞、组织或器官，在体外条件下进行的第一次培养。神经元原代培养是将胚胎哺乳动物中枢神经系统的部分组织，如海马组织、大脑皮层、小脑、下丘脑、海马、脊髓和神经丛从机体直接取出，再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多，但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。

目前，导致难以获得足够数量和活力的原代海马神经元的因素有以下几方面：(1)海马神经组织分离过程中，多数人用D-hank′s或hank′s作为漂洗液，离体哺乳动物海马组织中去除红细胞、被膜及结缔组织等杂质，分离过程时间较长，有时候需要2小时以上，在漂洗液中时间会更长，海马神经元即已部分死亡，从而出现假阴性的培养结果。实验上无法开展海马神经元的常规培养，主要可能是因为没有合适的用于海马组织标本的神经元培养用漂洗液／解剖液之故。在组织分离过程中，即使冰浴，神经元依然进行着很大程度代谢，hank′s液的无糖环境对神经元分离很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖来供给大脑的代谢，但葡萄糖浓度太高，易增加细菌污染的机会；添加DMEM培养液会碱性化，不利于神经元细胞存活。中国专利CN102978162A“一种神经元分离和培养方法及试剂”、中国专利CN102994452A“一种高效分离和培养神经元的方法”和中国专利CN102994451A“一种神经元分离和培养的改进型方法”，取脑组织放入盛有1×PBS的培养皿中，所采用清洗液均为PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，考虑到了神经元能量代谢需要，但未添加任何抗菌物质，葡萄糖浓度太高，就容易增加细胞污染的机会。(2)采用大剂量胰蛋白酶消化后，海马神经细胞势必受到相当程度的生比和机械损害；细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏，对于这类具有立体结构用以维持细胞增殖及自我更新的细胞来说，很难迅速恢复细胞状态，往往伴随着大范围的细胞死亡／凋亡，细胞“老化”严重，细胞活力将明显减弱，组织中不能获得大量活细胞；(3)细胞种植液对原代培养海马神经元至关重要，细胞种植液不同于接下来的细胞维持液，需要给予神经细胞特殊的生长因子，这样才能保证获得足够数量和活力的海马神经元。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种哺乳动物的海马神经元体外原代培养的方法，目的是建立一种简单易行、高纯度的海马神经元体外原代培养的方法及试剂，满足神经科学研究的需求。

本发明提供的技术方案之一为：

本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)LJM002，已于2011年05月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，保藏编号为CGMCC No.4900。

本发明的长双歧杆菌LJM002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。

本发明的长双歧杆菌LJM002菌株具有下述微生物学特征：

(1)菌落形态：长双歧杆菌LJM002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1～1.5mm。

(2)个体形态：G⁺无芽孢杆菌，杆状。