[发明专利]一种靶向结合线粒体DNA上TFAM的化合物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向结合线粒体DNA上TFAM的化合物及维持线粒体功能稳定的应用。

背景技术

生物素(biotin，B)又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，分子量为244.31，基本结构为双环结构：I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体、酶等。其化学结构中有咪唑酮环，可与亲和素(avidin，AV)和链酶亲和素(streptavidin，SA)特异性结合。生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。

川芎嗪(Ligustrazine)是中药川芎中含有的一种有效成分，具有抗血小板聚集的作用，并有扩张血管、增加冠脉血流量、改善微循环及增加脑血流量作用。临床适用于治疗缺血性心脏血管疾病，如冠心病、脑供血不足、脑血栓形成等。

线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)在维持线粒体功能稳定方面有着重要的作用。TFAM是由核DNA编码的25kD蛋白，TFAM蛋白包含了两个短串联的高迁移率族蛋白(high-mobilitygroup，HMG)盒域(box domains)，两者之间以27个氨基酸残基连接，其后是一个25个残基的C末端尾巴。

TFAM是线粒体DNA的结合蛋白，在线粒体DNA的转录、复制和维护上处于中心地位，它在线粒体呼吸链氧化磷酸化产生ATP的过程中也是必不可少的。具体的说是TFAM通过结合在线粒体DNA轻链和重链启动子的上游来促进线粒体DNA的转录。线粒体启动子的起始由TFAM的量调节，所以TFAM可影响基因的表达和线粒体DNA的转录起始。越来越多的证据表明，TFAM在维护线粒体DNA稳定和调节它的拷贝数上发挥着重要的作用，大部分TFAM蛋白可维护线粒体DNA的高级结构。线粒体DNA的拷贝数与TFAM蛋白的量紧密相关，这也进一步表明，TFAM蛋白和线粒体DNA之间的相互关系是动态的，一种组分的存在会增加另一组分的稳定性，从调节上来说，这种相互作用或许是有益的，因为TFAM蛋白或线粒体DNA水平的微小改变可使二者快速调节到最佳比率。研究表明，只需单独增加TFAM蛋白的表达就足以增加线粒体DNA的水平，可导致线粒体DNA编码多肽的增加和呼吸链稳定。

ATP依赖的Lon蛋白酶是一种具有多种功能的酶，其分子量约为100kDa，它在进化过程中非常保守，从archaea(古生菌)到哺乳动物的线粒体都有Lon的类似物，这表明Lon对于维持线粒体体内平衡极为关键。Lon具有蛋白酶的功能，介导异常或损伤的蛋白和短暂调控蛋白的降解来维持细胞体内平衡，在蛋白质量控制和代谢调控中起着重要作用。哺乳动物Lon蛋白酶的内源性底物为TFAM，此外还包括氧化的线粒体顺乌头酸酶、类固醇合成快速调控蛋白(StAR)以及细胞色素C氧化酶(COX)等。

因此，迫切需要一种靶向结合在线粒体DNA上TFAM却不被Lon蛋白酶降解的化合物，进而维持线粒体的功能稳定，而且能够达到靶向监测治疗。但到目前为止，还没有关靶向线粒体DNA上的TFAM却不被Lon蛋白酶降解的物质报道。

发明内容

本发明目的是提供了靶向性结合线粒体DNA上的TFAM，却不被Lon蛋白酶降解的生物素标记的川芎嗪，具有维持线粒体的功能稳定，而且能够达到靶向监测治疗的作用。

本发明提供的技术方案之一是：生物素标记的川芎嗪及其制备方法。

具体的结构式为：

生物素标记的川芎嗪的制备：首先将川芎嗪氧化成2-羟基-3,5,6-三甲基吡嗪，与D-生物素、EDCI，和DMAP按照12∶29∶30∶1的质量比溶解于无水DMF中，60℃条件下搅拌反应72h，TLC监测反应完全，将反应液倒入到30mL的乙醚中，4℃搅拌4h，析出白色沉淀，过滤，乙醚洗涤，粗品经柱层析纯化后得生物素标记的川芎嗪，产率为78％左右。

(1)2-羟基-3,5,6-三甲基吡嗪的合成，即中间体