[发明专利]基于dCAPS技术对日本看麦娘抗药性相关突变的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于衍生酶切扩增多态性(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS)方法来检测导致日本看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase，ACCase)抑制剂类除草剂产生抗性的相关突变的分子检测方法。可用于对日本看麦娘抗性相关突变进行快速准确的检测。

背景技术

日本看麦娘(Alopecurus japonicus Steud.)是我国油菜田和麦田的恶性禾本科杂草，因其与作物争肥、争水、争阳光、争空间，而对油菜和小麦的产量及品质造成严重危害。

ACCase抑制剂类除草剂是一类包括芳氧苯氧基丙酸酯类，环己烯酮类，新苯基吡唑啉类的具有杀草活性高、杀草谱广和选择性强等优点的除草剂。自70年代后期在我国油菜田和小麦田开始广泛使用，一直是油菜田和小麦田防除一年生禾本科杂草的主导药剂。但是近年来，日本看麦娘对此类除草剂的抗药性问题逐步显现，对我国油菜和小麦的粮食生产生了严重威胁。因此，对日本看麦娘的抗药性检测对于保障我国粮食生产安全至关重要。研究表明，在日本看麦娘中编码ACCase氨基酸的某些位点突变会导致其对ACCase抑制剂类除草剂产生抗药性，这些氨基酸突变为Ile-1781-Leu，Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu，Trp-2027-Cys，Ile-2041-Asn，Asp-2078-Gly。

对抗性相关突变的检测对于抗性日本看麦娘的监控及治理具有重要意义。dCAPS技术是一种通过等位基因快速准确检测SNP位点的技术。该技术通过在引物中导入错配碱基，使扩增的序列在一种基因型中产生酶切位点，而在另一种没有，PCR产物再经过相应的限制性内切酶酶切，通过限制性图谱分析可知SNP位点是否存在，从而对突变位点进行快速准确的检测。该技术已经在其他抗性杂草的抗性突变检测中得到了应用，但是在我国恶性杂草日本看麦娘的抗性检测中尚无应用。

发明内容

为了对日本看麦娘抗ACCase抑制剂类除草剂的抗性相关突变进行检测，本发明建立了一套基于dCAPS技术对抗性相关突变进行快速准确检测的分子检测方法。为实现该方法，本发明针对不同突变设计了相应的引物，筛选了合适的限制性内切酶，并对PCR扩增条件、琼脂糖凝胶电泳条件进行了优化。

本发明所述分子检测方法通过以下技术方案实现：

(1)根据日本看麦娘编码ACCase基因中与抗性相关的不同的突变位点，分别设计一对引物进行PCR扩增，使扩增产物在不同的基因型之间产生不同的酶切位点。

PCR扩增所用的引物为：

(2)用相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。

酶切所用的限制性内切酶为：

(3)酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，对电泳图谱分析便可明确是否产生了抗性突变。

对Ile-1781-Leu突变的检测中，敏感基因型产生可见的320bp条带，抗性纯合突变产生可见的271bp和不可见的49bp条带，抗性杂合突变产生可见的320bp、271bp条带和不可见的49bp条带；对Trp-1999-Cys突变的检测中，敏感基因型产生可见的359bp和不可见的47bp条带，抗性纯合突变产生可见的406bp条带，抗性杂合突变产生可见的406bp、359bp条带和不可见的47bp条带；对Trp-1999-Leu突变的检测中，敏感基因型产生可见的390bp条带，抗性纯合突变产生可见的349bp和不可见的41bp条带，抗性杂合突变产生可见的390bp、349bp条带和不可见的41bp条带；对Trp-2027-Cys突变的检测中，敏感基因型产生可见的317bp条带，抗性纯合突变产生可见的267bp和不可见的50bp条带，抗性杂合突变产生可见的317bp、267bp条带和不可见的50bp条带；对Ile-2041-Asn突变的检测中，敏感基因型产生可见的391bp条带，抗性纯合突变产生可见的351bp和不可见的40bp条带，抗性杂合突变产生可见的391bp、351bp条带和不可见的40bp条带；对Asp-2078-Gly突变的检测中，敏感基因型产生可见的331bp条带，抗性纯合突变产生可见的283bp和不可见的48bp条带，抗性杂合突变产生可见的331bp、283bp条带和不可见的48bp条带。