[发明专利]一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法

权利要求书

1.一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括：

（1）miRNA检测引物的设计：

茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；

qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；

（2）采用步骤（1）设计的miRNA检测引物将靶标miRNA反转录成cDNA；

（3）定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的靶标miRNA为miR-505-3P-RT¹、miR-505-3P-RT²或miR-16-RT。

3.根据权利要求2所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于：所述的miR-505-3P-RT¹对应的miRNA检测引物为：

PCR-F¹:GCGAGCACCGTCAACACTTG;PCR-R¹:TGGTGTCGTGGAGTCGGC。

4.根据权利要求2所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于：所述的miR-505-3P-RT²对应的miRNA检测引物为：

PCR-F²:GCGAGCACCGTCAACACT,PCR-R²:TGGTGTCGTGGAGTCGGC。

5.根据权利要求2所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于：所述的miR-16-RT对应的miRNA检测引物为：

PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT。

6.根据权利要求1所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的PCR扩增中PCR反应终体系20μL包括：10μL2×SYBR Green PCR master mix，0.4μL ROX，2.5μL cDNA模板，3μL PCR上下游引物2μM,4.1μL水，同时设阴性对照；PCR循环条件为95℃预变性2min，95℃变性15s，62℃延伸32s，共40个循环。